Epac/Rap1信号通路在急性肺损伤中作用的研究进展

汪雪峰，陈思煜，陈 锋

(浙江中医药大学第二临床医学院1.药剂科，2.放射科，浙江 杭州 310005)

急性肺损伤(acute lung injury，ALI)/急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是一类临床常见危重症，严重威胁重症患者的生命，病死率极高，达30% ～50%［1］。引起ALI的原因多种，其中以脓毒症、重症肺炎和严重创伤等为最主要原因。有研究表明，菌血症或脓毒症患者ARDS的发生率为18% ～38%，但病死率却高达90%，是引起ARDS死亡的主要原因之一［2］;同时，脓毒症休克中ARDS的发病率为37%，脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)达到检测水平的患者51%出现ARDS，而低于检测水平的患者只有26%发展为ARDS，提示血中LPS水平决定ARDS发生的危险性，LPS是引起ALI/ARDS的重要致病因子。

ALI致病因素多样，发病机制复杂。作为多种ALI致病因素的共同通路，肺损伤过程中的炎症反应失调控在ALI疾病发生、发展过程中的关键性作用已经得到公认［3］。随着失控的炎症反应引发多器官功能紊乱综合征理论的出现，对ALI的认识转向对炎症发生、调控，参与炎症的炎症细胞和细胞因子则成为研究的热点，这些细胞和细胞因子、炎症介质构成了ALI炎症反应和免疫调节的“细胞网络”和“细胞因子网络”在其发病过程中发挥重要作用。复杂的发病机制为药物治疗提供了可能的靶点，对此也进行了相当多的探索。目前医学界针对ALI中的相关通路研究逐渐增多，尤其cAMP活化交换蛋白Epac/Rap1这一信号通路正成为国内外许多学者的研究热点。本文就ALI/ARDS中气道炎症及Epac/Rap1信号通路在ALI中的研究现状作一综述。

1 ALI/ARDS的病因及发病机制

ALI/ARDS病理特征是肺泡毛细血管屏障损伤、通透性增加而使富含蛋白的液体流入肺泡，引起肺不张，通气/血流比例失调而导致呼吸衰竭。在LPS性ALI/ARDS中，LPS对微血管内皮的直接损伤作用对疾病的发生也起到重要的作用。Anjum等［4］研究发现，LPS诱导的肺微血管内皮细胞单层通透性增高与F肌动蛋白解聚密切相关，并且使肺肾上腺素受体出现明显下调，显示LPS对肺微血管内皮细胞有直接的损伤作用。Okajima等［5］发现肺血管内皮细胞可被直接激活，通过产生氧化亚氮和前列腺素，调节炎性反应而损伤肺组织。LPS刺激30 min后，即可观察到内皮细胞收缩，胞膜皱缩，细胞间连接松解，间裂形成，通透性增加。这种微血管通透性的增加出现在炎性细胞因子如肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)、白细胞介素 1(interleukin-1，IL-1)的血浆峰值及黏附分子表达之前。可见，LPS可直接损伤肺泡毛细血管屏障引起ALI/ARDS的发生。

细胞内炎症信号通路的激活是ALI炎症反应的核心事件，炎症信号通路的失调控以及炎症因子平衡紊乱则是ALI发生和发展的重要原因。目前发现ALI发病过程中的多种理化因素刺激均能够激活细胞内炎症信号通路。一些病原体源性物质如LPS等能够识别细胞膜上一类跨膜蛋白Toll样受体而激活胞内炎症信号通路［6］，并通过多种信号转导途径及相关受体造成肺损伤、抑制炎症等是ALI/ARDS治疗的主要作用手段。

2 Epac/Rap1信号通路在ALI中的作用机制

2.1 Epac/Rap1信号通路的发现

cAMP作为细胞内第二信使对于正确转导细胞内外的各种信息至关重要，是多种信号转导过程中的关键因子。有学者研究发现，增高细胞内的cAMP水平能明显增加肺血管内皮细胞的保护性，改善凝血酶、LPS等多种因素引起的ALI/ARDS肺内皮细胞的功能障碍。一般认为cAMP的绝大多数功能是通过蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)实现的，但进一步深入研究发现，通过PKA抑制剂(PKI)抑制cAMP依赖性蛋白激酶PKA，细胞内高浓度的cAMP依然能发挥对内皮细胞的保护作用［7］，提示cAMP非PKA依赖性信号通路的存在，这条新的信号通路参与高浓度的cAMP激活并产生与PKA相类似的效应。

8-Pcpt-2'-O-Me-cAMP是cAMP的一个同源物，它可以特异地激活Epac，而不影响PKA的活性。利用这一人工合成物，研究者已将Epac蛋白定位在cAMP介入的信号转导途径的一个非常重要的位置上。例如，Epac已被证明介入了细胞增殖过程;VE-/钙黏素介导的细胞间的连结的形成过程;整合蛋白介导的细胞核基质的附着过程;胰岛素的分泌过程以及钠质子泵交换活性的调控过程。

2.2 Epac/Rap1信号通路与肺部炎症

近期研究发现，Epac在调节肺部的气道炎症和细胞增殖方面是一个新的效应器［10］，并且发现Epac在肺部的多种细胞中都有表达，如内皮细胞，成纤维细胞和肺泡巨噬细胞等，并在这些细胞的免疫应答过程中发挥重要作用，如在大鼠肺纤维化模型中，Epac1呈先下降后升高趋势，Epac2呈持续下降趋势，提示 Epac可能参与了肺纤维化的发生发展过程［11］。

Epac作为Rap1特异的GEF，能直接与cAMP结合而被活化，进而激活GTP酶 Rap1，通过Rap1途径发挥许多生物学效应。如激活的Rap1在整合素介导的细胞黏附［12］、钙黏素介导的细胞整合形成和内皮细胞膜的调节等多个过程中起作用［13-14］，Rap1的激活诱导 Rac特定的 GEF小分子Tiam1和Vav2在细胞膜外围聚集［12，15］，进而激活小分子 GTP酶Rac，活化的Rac反过来刺激效应信号激酶1型蛋白激酶A(protein kinase 1，PKA1)及细胞骨架，和细胞连接相关的下游效应器，诱导肌动蛋白细胞骨架的黏着斑和黏合带的重排，增加单层EC的屏障功能［13，16-19］。Epac蛋白在这些细胞中如何表达以及外界刺激引起的机体病理生理的改变是否引起Epac的相应的表达改变还不是很清楚，虽然已经明确炎症因子能够改变Epac的表达，但具体机制也尚未研究清楚［20］。

Helms等［21］在研究顶膜和基底膜外侧多巴胺对肺泡Ⅱ型细胞单层顶膜高选择性钠通道的影响时发现，多巴胺通过cAMP/Epac/Rapl途径增加钠通道开放率，增强ENaC活性，而非cAMP-PKA途径，此途径通过肺泡Ⅱ型细胞的多巴胺D1受体而不是β受体。实验中Cpt-2-O-Me-cAMP(能选择性结合和激活Epac，而不激活PKA)可增加ENaC开放率，可被多巴胺 D1受体拮抗剂(SCH-23390)、Src抑制剂(PPP2)、PI3K抑制剂(LY-294002)、MEK 拮抗剂 U0126、磷脂酶A2抑制剂、蛋白磷酸酶抑制剂所阻断;但不能被多巴胺D2受体拮抗剂、PKA抑制剂阻断。同时cAMP-Epac-Rap1可激活DARPP32(多巴胺和cAMP调节的磷酸化蛋白)，引起DARPP32磷酸化，阻断多巴胺对ENaC活性，还通过MAPK途径增强钠泵活性，引起肺水清除增加。

2.3 Epac/Rap1信号通路在ALI发病中的作用

Epac的发现促使人们重新审视cAMP的不同生物学效应的下游机制，Epac不仅能协同或拮抗PKA的作用，而且能独立介导cAMP的生物学效应。cAMP在体内和体外能很明显地诱导Epac对Rap1的鸟苷酸交换能力［22-25］，Birukova等［24］在机械通气所导致的ALI模型中发现，伊洛前列素对ALI中受损的肺血管内皮细胞通透性的保护作用不仅仅是通过cAMP浓度升高激活PKA通路来实现的，还发现了非依赖PKA的新的信号通路Epac-Rap1-Tiam1/Vav2的存在。他们认为，在凝血酶所导致的急性肺损伤模型中，Epac/Rap和PKA两条信号通路也是同时存在的［23］，但在LPS和TNFα刺激诱导肺损伤动物模型中，发现心钠素能明显提高细胞内cAMP浓度，保护血管内皮，基于前期其他模型中的研究，提示LPS和TNFα可能通过Epac/Rap1和 PKA两条信号通路发挥作用，但是到目前为止，尚未证实在LPS诱导的ALI模型中cAMP是否通过Epac/Rap1这条通路起作用。

在ALI中cAMP/Epac/Rap1信号通路参与并行使许多类型细胞的功能，包括细胞分泌、细胞间黏附和连接、细胞凋亡、细胞增殖和分化等［26-27］。进一步研究发现，Epac/Rap1信号通路在多种类型细胞中都参与调节细胞的迁移、整合蛋白介导的细胞黏附等［28］。最近，Lyle等［29］报道 cAMP介导的Epac/Rap1在稳定黏着斑的基础上调节上皮细胞的迁移和抑制细胞膜的突起，可能是通过调节细胞骨架的整合素之间的相互作用。有趣的是，最近的证据显示，Epac和Rap蛋白可调节在钙黏素重新分布的基础上的内皮细胞连接的形成。事实上，Epac和Rap调节细胞和细胞外基质蛋白、纤连蛋白的接触和黏连，在多种细胞系中，这个过程涉及细胞骨架动力学和细胞间黏附与迁移的调制。Epac/Rap1信号通路与层连蛋白-5关系密切，因为层连蛋白-5在肺部炎症中是生长因子诱导的侵入性生长的一个显著转接器。更重要的是，EPAC参与的抗炎是通过抑制NF-κB和调节炎症基因的表达，Epac/Rap1信号通路调节抑制因子-3和IL-6受体等。在LPS诱导的 ALI中，Epac通过 PKB/Akt和 GSK-3减少IFN-β的产生［30］，但在肺泡巨噬细胞中并不改变巨噬细胞炎性蛋白质1α(macrophage inflammatory protein-1α，MIP-1α)和MIP-1β的产生，然而，在RAW264.7细胞系中，小鼠肺泡巨噬细胞中Epac的激活可增加前炎症因子IL-1β和IL-6的产生。这些数据表明，在不同的细胞类型中，Epac可增加或减少炎症介质的产生，但在这些不同类型的细胞中Epac/Rap1信号通路调节的炎症机制还有待进一步的研究。

3 结语

Epac是一类新的cAMP下游效应分子，能与cAMP直接结合的GEF。肺血管内皮细胞通透性的改变在ALI中具重要地位，而Epac在肺血管通透性上起重要作用，有文献报道Epac/Rap1通路介导PGE2诱导的血管内皮通透性增加。我们前期在LPS诱导的ALI小鼠模型中，采用蛋白印迹实验，结果表明，Epac1在 LPS诱导的 ALI中表达是下调的，而Epac2在肺内不表达(未发表)。提示 cAMP-Epac-Rap1-Tiam1/Vav2-Rac1在LPS诱导的ALI的发病机制中可能存在显著的意义。

综上所述，Epac/Rap1信号通路在ALI/ARDS发病过程中发挥重要作用，调节Epac-Rap1信号通路可能成为ALI/ARDS的治疗新靶点，但是ALI/ARDS致病因素多样，发病机制复杂，对于其中的信号通路调节，研究证明多种相关蛋白质和生物小分子均可参与信号调节，深入了解这些分子间的作用机制对于我们寻找最佳靶点、选择合适的激动剂和抑制剂进行疾病治疗至关重要，有待于进一步研究。

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