细胞自噬和缺血性脑卒中

郭 强 韦 强 边心超 张金柱 王宏磊 (吉林大学白求恩第一医院神经外科，吉林 长春 130021)

自噬作为Ⅱ型程序性细胞死亡，在肿瘤、老化和神经退化等细胞增殖和死亡紊乱疾病中发挥着重要的作用。近年来，越来越多的学者关注到在缺血性脑卒中不仅有细胞的凋亡和坏死的参与，尚有细胞自噬参与其中。本文就细胞自噬和缺血性脑卒中的研究进展予以综述。

1 自噬的概念

自噬(autophagy)是细胞利用溶酶体降解自身受损的细胞器和大分子物质的过程，是生命进化过程中一种保守的细胞行为，也是真核细胞特有的生命现象。自噬参与了细胞对持续性内外刺激的非损伤性应答反应，在维持细胞结构、代谢和功能的平衡方面起重要的作用〔1〕。在细胞的正常生长和分裂中，必然会出现一些不需要的生物大分子和受损、衰老的细胞器，而自噬就参与这些物质的降解和再利用。通常这些待降解物首先被细胞内单层或双层膜包裹形成自噬体，然后运送到溶酶体形成自噬溶酶体，最后在溶酶体内被多种水解酶水解。

首先，水解生成的氨基酸和脂肪酸可以被用来合成新的蛋白质或参与能量代谢。而该作用在细胞应对各种不利应激的情况下(如营养缺乏、生长因子撤离、辐射等)，尤为重要。通过这种方式细胞可以获取制造ATP、保证基本代谢过程的营养物质，从而限制其损伤和死亡〔2〕。

其次，通过自噬及时清除多余或损伤的细胞器，对于稳定细胞的形状和结构，维持细胞的正常功能和避免细胞衰老等至关重要。再次，消灭致病微生物，并参与抗原递呈过程〔3〕。但是，自噬的过度发生可诱导细胞发生程序性死亡，从而引起一系列疾病过程〔4〕。这种自噬性程序性细胞死亡同凋亡(I型程序性死亡)明显相异，被学者称为Ⅱ型程序性死亡〔5〕。

2 细胞自噬的过程

自噬是胞浆大分子物质和细胞器在双层膜包囊泡中大量降解的生物学过程。在此过程中自噬体的形成是关键。其发生过程大致分为3个阶段:

2.1 自噬诱导 在饥饿、氧化应激损伤等情况下，粗面内质网的非核糖体区域、高尔基体等来源的自噬体膜脱落形成杯状分隔膜，包绕在被降解物周围〔6，7〕。自噬前体的诱导过程可以是选择性的，也可以是非选择性的，分别称为选择性自噬和非选择性自噬，前者是指游离膜结构识别并包裹胞质内的特殊底物形成自噬体，并将其降解，如Cvt途径(cytoplasm to vacuole targeting pathway)和过氧化酶体降解(pexophagy)途径;后者是指随机包裹细胞质形成自噬体。酿酒酵母是选择性自噬的典型的例子，酿酒酵母细胞质中的Apel蛋白(aminopeptidase 1)通过Cvt途径直接运输至双层膜泡结构〔8〕。选择性自噬主要由细胞内的底物诱导发生，而非选择性自噬主要是对细胞外刺激发生反应的结果。在饥饿或生长因子缺乏时可诱导非选择性自噬的发生。缺氧的信号使mTOR信号途径失活，从而激活自噬信号途径。在细胞内信号级联放大的作用下，Atg相关蛋白被修饰而诱导自噬的发生。

2.2 自噬体形成 分隔膜逐渐延伸，将要被降解的胞浆成分完全包绕形成自噬体。自噬前体诱导形成后，游离膜结构继续与自噬前体结合，逐渐构成自噬体。在Cvt途径，游离膜以底物作为支架添加到自噬前体上，使自噬前体逐渐形成自噬体。

非选择性自噬是依靠Atgl2-At95-Atgl6复合物为支架完成自噬体形成。细胞质内的Atg12、At95和Atgl6被募集到自噬前体的双层膜结构上，并形成较大的寡聚复合体。此决定双层膜的曲度，并募集含有At98的游离膜结构，使自噬前体双层膜结构不断延长，形成自噬体〔9〕。

2.3 自噬体内容物的降解 自噬体通过细胞骨架微管系统运输至溶酶体，与之融合形成自噬溶酶体并降解其内成分，自噬体膜脱落再循环利用〔10〕。Atgl2-At95复合物与 Atgl6解聚，At98从自噬体上脱离下来后，自噬体被运输至溶酶体，其外膜与溶酶体膜融合，自噬体内膜及其内容物进入溶酶体腔。在各种酸性酶的催化下，底物降解为氨基酸、脂肪酸等小分子物质。

调节上述复杂的过程的分子水平有五个关键阶段〔11〕:(1)形成吞噬泡。(2)At95-12复合物与Atgl6L多聚化。(3)LC3形成并且插入吞噬泡膜。(4)包绕预被降解物。(5)自噬体与溶酶体融合〔12〕。

3 自噬的调控机制

3.1 依赖mTOR(marnmalian target of rapamycin)途径的自噬

雷帕霉素靶蛋白mTOR，是一种氨基酸、ATP、生长因子、胰岛素等分子的感受器，在调节细胞生长，抑制自噬方面起关键性作用。酵母中Ser/Thr蛋白激酶Atgl于其他Atg分子结合定位于自噬体前膜上。饥饿刺激下，Atgl3去磷酸化，并与Atgl结合，导致Atgl7依赖性自噬的发生〔13〕。mTOR活性抑制时，促进自噬体形成，在酵母中是通过Atsl和Atgl3去磷酸化而促进下游自噬信号，但在人类中的是否为该机制尚不明了。mTOR活性增强时，通过磷酸化S6KI激活之，进而磷酸化核糖体蛋白S6

(p70s6)来促进mRNA翻译，同时促使核糖体与内质网的黏附而抑制内质网膜脱落形成自噬体膜。mTOR同时也磷酸化4EBPs并抑制其活性，解除了对真核细胞翻译启动因子elF4E的抑制〔14〕。有研究发现在氨基酸丰富时，mTOR信号激活，自噬被抑制，S6K1活性增强，增加了mRNA翻译、蛋白质合成。氨基酸缺乏时，原料减少，蛋白质合成减少，同时mTOR信号被抑制，自噬增强，S6KI活性减弱，负反馈IRS/Class I PDK的作用减弱，也增强了自噬〔15，16〕。

3.2 依赖磷脂酰肌醇三磷酸激酶(ClassⅢPI3K)途径的自噬Ⅲ型磷脂酰肌醇三磷酸激酶(Class III PI3K)复合物(Atg6-Atgl4-Vpsl5-ClassⅢPI3K)在细胞自噬中扮演重要的角色。它可以将磷脂酰肌醇(PI)磷酸化为3-磷脂酰肌醇(PI3P)，进而募集胞浆中含-FYVE-或-PX-基序的蛋白质，用于自噬体膜的形成〔17〕。另外抑癌基因Atg6的哺乳动物同源体beclinl和抑癌基因UVRAG作为自噬正调控子，抗凋亡因子bcl-2作为自噬负调控子共同参与组成Class III PI3K复合物调控自噬〔18，19〕。经典的自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)并非作用于mTOR途径，而是通过抑制ClassmPI3K的活性从而抑制自噬形成。

3.3 Ras/PKA通路 有研究证实:哺乳动物和酵母细胞细胞中Ras/PKA通路可感受细胞外葡萄糖含量的变化，并影响到自噬基因的表达。在酵母细胞中，Ras/PKA通路通过抑制TOR而抑制自噬，表明Ras/PKA通路抑制自噬作用与TOR-Tap42通路平行。Atgl作为PKA的磷酸化底物可能参与到Ras/PKA通路的调节当中，使Ras/PKA抑制自噬得以实现。同时酵母细胞中的sch9与哺乳作用与动物细胞中的PKB/Akt相似，也参与感受细胞外葡萄糖水平。

3.4 AMPK途径 自噬活性对细胞存活十分重要。在哺乳动物细胞中，AMPK感受ATP的水平。通过上游激酶LKBl下调ATP/AMP比例而激活AMPK。活性的AMPK诱导TSCl/2复合体磷酸化并有活性，TSCl/2复合体可通过Rheb抑制mTOR活性。除此之外，LKBl-AMPK使P27磷酸化并有活性，后者可在生长因子缺乏或营养缺乏时阻滞细胞凋亡而诱导自噬。与AMPK相同，酵母细胞中的Snfl也可正向诱导自噬。

4 自噬和缺血性脑卒中

自噬(autophagy)是细胞适应恶劣环境的一种生存机制，通过这种方式细胞可以获取制造ATP、保证基本代谢过程的营养物质，从而限制其损伤和死亡。从这一观点出发，认为自噬具有神经保护作用〔20〕。Puyal和 Clarke〔21〕在大鼠脑缺血模型研究中观察到，缺血灶周围脑组织神经元中的溶酶体和自噬活动均显著增强，认为自噬活动对缺血周围脑组织具有保护作用。有研究表明脑缺血缺氧后，自噬基因ATG7缺失的新生鼠较正常新生鼠能够有效的减轻脑损伤，不但能够减少自噬性死亡，而且减少了凋亡;ATG7缺失的成年鼠脑缺血缺氧后，自噬性死亡是海马锥体细胞死亡的重要方式〔22〕。Carloni等〔23〕在新生小鼠缺血缺氧性脑损伤模型研究中发现，脑缺血后海马和大脑皮质神经元中的自噬相关基因Beclin-1表达上调，并在24 h达高峰;同样，IPC后Beclin-l表达也显著上调。在缺血前20 min经侧脑室注入自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3.methyladenine，3-MA)可显著下调Beclin-l表达，同时海马和皮质神经元死亡显著增多;相反，经侧脑室注入自噬激活剂雷帕霉素(rapomycin)可显著上调Beclin-1表达，同时海马和皮质神经元死亡显著减少。最近，Carloni等〔24〕进一步研究发现，自噬激活剂雷帕霉素能抑制核糖体s6蛋白激酶(ribosomes 6 protein kinase，pTOS6K)磷酸化以及显著上调Beclin-l和LC3表达，而自噬抑制剂渥曼青霉素(wort，mnnin)可显著减少Akt和cAMP的应答元件结合蛋白(eAIVIPresponse element-binding protein，CREB)磷酸化，但不会影响p70S6K磷酸化以及Beclin-I和I.L-3表达。Tizon等〔25〕证实，半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(Cystatin C，CysC)可以通过抑制哺乳动物mTOR通路诱导细胞自噬，从而保护小鼠皮质神经元。因此认为通过调节CysC表达有望为缺血性卒中的一个治疗靶点。

但现有的研究结果却并不完全一致。因过度激活的自噬会引起Ⅱ型细胞发生程序性死亡，故有学者又认为自噬的激活也是导致神经元死亡的重要原因〔26，27〕。成年大鼠大脑中动脉闭塞模型研究表明，缺血半暗带区域的自噬显著激活，应用自噬抑制剂3-MA或巴弗洛霉素A1(bafliomycin A1)阻断自噬，可使梗死体积显著缩小，脑水肿和大鼠行为学损害均得到显著改善〔28，29〕。Koike 等〔30〕采 用 自 噬 基 因 缺 陷 大 鼠、胱 冬 酶(caspase)-3基因缺陷大鼠以及胱冬酶活化DNA酶抑制大鼠模型来分析脑缺血缺氧性损伤后的神经元死亡情况，结果证实，自噬基因Atg7表达阴性的大鼠海马锥体细胞自噬受到明显抑制，同时海马区神经元死亡较对照组明显减少。由此推测，自噬的产生可能会加重神经元损害，促进其死亡，从而对自噬在脑缺血后的保护作用提出了质疑。因此，自噬在脑缺血缺氧性损害中的确切作用仍然存在争议，自噬是加重还是减轻缺血后神经元损害尚需进一步的研究证实。

5 展望

随着国内外学者对细胞自噬在心脑血管缺血缺氧、缺血再灌注及细胞凋亡等方面的研究，自噬同脑卒中的密切关系正被人们发现并重视。对脑卒后缺血半暗带的保护一直是国内外学者研究的热点，而自噬在脑缺血半暗带病理生理变化中扮演着重要的角色。相信随着分子生物学研究的进一步深化，我们能够找到自噬通路中某些关键的靶点。通过这些关键点我们可能成功逆转某些卒中病人的神经功能损害，为人类的健康作出里程碑式的贡献。

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