bcl-2、bax、caspase-3在细胞凋亡中的作用及其关系

董雅洁 高维娟 (承德医学院病理生理学教研室，河北 承德 067000)

细胞凋亡是细胞在一定的生理或病理条件下，受多种基因精确调控的主动的、程序化的死亡过程，是机体重要的自稳调节机制〔1〕。近年来通过大量实验研究表明，线粒体通路在细胞存亡机制中起着至关重要的作用，而在众多的凋亡调控基因中，bcl-2蛋白家族和胱天蛋白酶(caspase)家族目前最受关注，其中bcl-2基因和bax基因是目前已知的在凋亡调控过程中功能相互对立的一对最重要的调控基因，caspase-3是凋亡过程中最关键的凋亡执行蛋白酶，三者在细胞凋亡过程中的关系已成为凋亡研究中的热点问题，本文将就此做一综述。

1 bcl-2蛋白与细胞凋亡

1.1 bcl-2蛋白家族的分类、结构与功能 bcl-2是B细胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukemia 2，bcl-2)的缩写，与秀丽隐杆线虫的生存基因Ced-9有高度同源性，是细胞凋亡信号转导途径中关键的凋亡调节因子。目前已发现有20余种bcl-2蛋白家族成员，这一多基因家族均由决定蛋白亚细胞定位的羧基端疏水性跨膜结构域(TM)和数量不等的bcl-2同源结构域所构成。根据其功能和结构的不同可将bcl-2基因家族分为三类：第一类是 bcl-2 亚家族，包括：bcl-2、bcl-xl、bcl-w、Mcl-l、bfl-1/A1和bcl-G等，它们一般均同时含有BH1～BH4四个同源结构域，其中BH4是抗凋亡蛋白所特有的结构域，决定着抑制细胞凋亡功能的存在〔2〕;第二类是Bax亚家族，包括：bax、bak等，其结构中一般都含有BH1、BH2和BH3三个结构域，可促进细胞的凋亡;第三类是促细胞凋亡蛋白中的特殊成员BH3亚家族，包括 bad、bid、bim、bik、Puma和 Noxa等，此亚家族最显著的特点是仅含有一个BH3结构域，BH3结构域被认为是细胞凋亡所必需的致死性结构域，起促凋亡活性的发挥至关重要〔3〕。

1.1.1 bcl-2的结构及功能 抗凋亡基因代表成员bcl-2是第一个被确认的能对抗细胞凋亡的基因，与Ced-9基因同源性为23%，由239个氨基酸残基所构成，定位于18号染色体21区，含3个外显子和2个内含子，可编码26 kD的bcl-2α和22 kD的bcl-2β两种蛋白，其中bcl-2α是抑制凋亡作用发挥的主要蛋白，为线粒体膜的整合蛋白〔4〕。三维结构研究显示，bcl-2是由位于中心的两个长疏水性α-螺旋(α5和α6)包绕着外周五个亲水性两性α-螺旋构成的七螺旋拓扑结构。在其肽链的C末端具有由19个疏水性氨基酸片段组成的跨膜结构区域，可通过该疏水区锚定于线粒体外膜、外核膜及部分内质网膜表面，是阻止凋亡早期征象发生的重要区域〔5〕。

1.1.2 bax的结构及功能 bax作为促凋亡代表成员位于19q13.3～q13.4区，由6个外显子和5个内含子组成，能够编码α、β、γ、δ、ε和σ6种bax蛋白亚型。多项实验证明，bax基因编码的具有生物学活性的baxα由192个氨基酸组成，分子量为21 kD，是bax基因在细胞中发挥促凋亡作用的主要表达形式。蛋白质序列分析显示，baxα蛋白其21%的氨基酸与bcl-2具有同源性，且集中在C端的保守区。

1.2 bcl-2蛋白家族在细胞凋亡中的调控机制

1.2.1 bcl-2在细胞凋亡中的调控机制 定位于线粒体外膜上的bcl-2至少在三个水平上发挥凋亡抑制作用：(1)通过抑制谷胱甘肽的外泄、降低/对抗线粒体巯基的氧化还原状态以控制其膜电位从而抑制细胞凋亡的发生;(2)通过介导线粒体外膜通透转运孔(PT)孔道复合体的开放，抑制细胞色素c(cyt-c)和凋亡诱导因子AIF等促凋亡蛋白的释放阻止凋亡的进程;(3)通过与胱冬肽酶的间接作用，将凋亡蛋白酶激活因子Apaf-1定位至线粒体膜，通过对其结构的调控阻断凋亡蛋白酶的激活，组织cty-c作用的发挥，使细胞免于死亡〔6〕。

定位于内质网膜上的bcl-2抗细胞凋亡作用的发挥主要与胞内的Ca2+浓度高低有关〔7〕。在凋亡的早期，内质网中的Ca2+持续释放，导致胞质中的Ca2+浓度持续增高可充当凋亡的启动信号引发细胞凋亡〔8〕。Ling等〔9〕发现，高表达的 bcl-2可明显抑制K+引起的Ca2+浓度升高，且这种抑制作用在加入bcl-2抑制剂后消失。应用转基因方法发现，bcl-2高表达可抑制Ca2+从内质网向胞质中的跨膜流动，使Ca2+依赖性核酸内切酶活性降低，胞质中Ca2+浓度处于稳定水平，从而抑制细胞凋亡。

1.2.2 bax在细胞凋亡中的调控机制 bax蛋白多以非活性单体形式分布于胞质中，只有在接收到凋亡信号刺激被激活后，发生分子构想改变，移位并插入线粒体外膜后形成bax大孔道，破坏线粒体膜的完整性，并于bcl-2等抑制凋亡的蛋白对抗，阻止其抗凋亡作用的发挥〔10〕。

1.2.3 bcl-2、bax蛋白间的相互作用关系 高分辨三维结构研究显示，bcl-2、bax蛋白中的BH1和BH2两个同源结构域可形成一疏水凹槽，分别与其N端的α-螺旋(bcl-2为BH3、BH4螺旋，bax仅有BH3螺旋片段)通过静电和疏水作用结合形成同源二聚体;而易位至线粒体外膜上的促凋亡蛋白bax表面暴露的BH3螺旋可与抗凋亡的bcl-2蛋白表面的疏水凹槽结合，形成异源二聚体〔11〕。特定的蛋白二聚体对细胞凋亡进程产生不同的影响，这是bcl-2蛋白家族在细胞死亡信号转导调控过程中所特有的重要特征，是凋亡“主开关”作用发挥的重要结构域。研究发现，通常情况下bcl-2和bax两种蛋白的表达量相对稳定，而当bax在细胞内超表达时，bax/bax同源二聚体的数量明显增多，细胞对死亡信号的反应性增强，启动凋亡;而当bcl-2高表达时，则bax/bax二聚体大量解离，生成更为稳定的bcl-2/bax异源二聚体，对抗其诱导凋亡的作用，使细胞存活期延长〔12〕。因此，多项研究〔13，14〕认为细胞内这两种对立蛋白间的比率关系是决定细胞存亡的关键。

2 caspase蛋白与细胞凋亡

2.1 caspase蛋白家族的分类、结构与功能 caspase是一类存在于胞质中的半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶，与线虫的自杀基因CED-3同源，在细胞凋亡的过程中起着极其关键性作用〔15〕。迄今在哺乳动物中已发现该蛋白家族有14个性质不同的成员，按发现的顺序依次命名为caspase-1至caspase-14，其中至少有8个与细胞凋亡有关〔16〕。

根据在细胞凋亡过程中的结构和功能可将caspase蛋白酶分为三大类：第一类是炎症有关亚类，包括 caspase-l、4、5、13、14及小鼠caspase-11、12，主要参与促炎因子的成熟，在细胞凋亡进程中起辅助作用;第二类是凋亡启动亚类：包括caspase-2、8、9、10，这一亚类蛋白酶位于级联反应上游，在结构上一般都具有较长的原结构域，能参与启动下游的caspase蛋白酶〔17〕;第三类是凋亡效应亚类：包括caspase-3、6、7，位于级联反应下游，一般分子相对较小，缺少蛋白质结合结构域，执行剪切细胞结构蛋白的作用，直接使细胞发生凋亡〔18〕。

caspase家族成员具有以下共同特点：①每个成员在催化位点上均含有一个特异性的五肽序列QACXG;②在胞浆内均以相对分子量为30～50 kD的无活性的酶原形式存在，一个N端前域(prodomain)及一个由大小两个亚基构成的C端酶作用域;③酶活性依赖于半胱氨酸残基的亲核性;④对在底物N-末端裂解位点上的天门冬氨酸具有高度的特异性;⑤经蛋白水解激活后大小亚基解离重组形成异四聚体活性形式。⑥caspase可自我活化并能相互激活，凋亡过程一旦触发，即以联级放大的方式进行;⑦正常情况下细胞内caspase总是与其抑制剂共存，以免caspase酶原被意外激活而对正常细胞造成损伤。

2.2 caspase-3在细胞凋亡中的作用机制 凋亡发生是一个由caspase家族成员介导的蛋白酶级联反应过程，即caspases在凋亡诱导信号的作用下，启动型caspases先通过结合特异辅因子而激活，发挥水解蛋白的作用，从而激活下游效应型caspases，一旦效应caspase被激活，便大范围的水解细胞内的靶物质，从而降解细胞内蛋白，最终使细胞不可逆的走向死亡〔19〕。caspase-3是ICE(白细胞介素1-β转化酶)家族成员之一，又称为半胱氨酸蛋白酶32(CPP32)，与Ced-3同源性最高，是主要的效应caspase，是多种凋亡途径的共同下游效应部分，在细胞凋亡过程中占据核心地位，被称为“死亡执行蛋白酶”〔20〕。其主要受粒酶 B、caspase-l、caspase-2、caspase-10、CPP32 激活蛋白酶(CAP)以及自身等所活化，活化后的caspase-3酶解切割DNA-PK(DNA依赖的蛋白激酶)和PARP(聚腺苷二磷酸核糖多聚酶)等，从而影响DNA复制、转录和损伤修复〔21〕。

3 bcl-2、bax和caspase-3在细胞凋亡中的相互关系

细胞凋亡的发生和发展可以概括为凋亡诱导、调控执行和效应三个阶段，现已证明至少有线粒体途径、死亡受体途径和内质网途径三条通路参与凋亡的发生〔22〕。其中线粒体依赖途径是主要的传导途径，JNK通路是主要信号转导通路，cyt-c是线粒体电子电子传递链上的一个重要组成部分，其从线粒体释放是凋亡启动的关键步骤〔23〕。caspase-3作为caspase级联反应下游最关键的凋亡执行者，其激活在很大程度上依赖于cyt-c的释放，而bcl-2家族中的bcl-2、bax基因是目前已知的细胞凋亡中最重要的调控基因，可通过线粒体途径介导cyt-c等物质释放。随着近年来关于bcl-2、bax和caspase-3在细胞凋亡信号传导过程中关系研究的进一步深入，发现bcl-2、bax不但可作为caspase-3的上游调控机制，参与对 caspase-3活性的调节〔24〕，还可作为 caspase-3的直接底物作用于 caspase-3的下游，二者在细胞凋亡传导过程中既相互联系又相互制约。

3.1 bcl-2、bax可作为caspase-3的上游调控机制 bcl-2、bax蛋白位于线粒体上游，是线粒体膜的通透性改变的重要调控因素〔25〕，其过度表达能控制cyt-c的释放和下游caspase-3蛋白酶的活化，介导细胞的存活或死亡〔26〕。bax在死亡信号刺激下可转位至线粒体膜上，形成同源二聚体或多聚体，并在线粒体膜上形成通透性PT孔道，破坏膜内离子及蛋白浓度差，释放出cyt-c等促凋亡因子〔27〕。在dATP存在下cyt-c通过半胱氨酸蛋白酶作用域与Apaf-1结合形成凋亡体，并招募procaspase-9在其上寡聚〔28〕，进而激活 caspase-3，启动 caspase 级联反应〔29〕。超表达的bcl-2蛋白一方面可与bax形成异源二聚体，抑制bax的转位及二聚体化，关闭PT孔道，通过阻断cyt-c的释放，抑制下游caspase-3的激活，而有效地抑制细胞凋亡的发生〔30〕。另一方面，bcl-2还能与 Apaf-1结合并抑制其功能，阻止 procaspase-9活化实现抗凋亡的效应〔11〕。此外，有研究发现bcl-2的过度表达可引起细胞核谷胱甘肽积聚，导致核内氧化还原平衡的改变，阻止胞内Ca2+流动，抑制线粒体膜释放cyt-c，从而抑制caspase-3的活化，阻断凋亡进程。

3.2 caspase-3可作为bcl-2的上游调控机制 bcl-2可作为caspase-3的直接作用底物，bcl-2蛋白的N端可变环区可被caspase-3在Asp34处剪切，裂解为具有类bax促凋亡活性功能的片段，加速凋亡进程。这一步骤被证明是凋亡信号转导最关键限速步骤之一〔31〕。Kirsch等〔31〕用细胞凋亡提取物诱发细胞凋亡时，可见bcl-2的剪切片段。在对提取物进行caspase-3免疫清除后，bcl-2则不被剪切。当用stau-rosporine(一种癌基因抑活药)诱导缺乏caspase-3表达的MCF-7细胞凋亡时，bcl-2也不被剪切，由此说明caspase-3是bcl-2的生理性酶解蛋白酶，可构成阳性凋亡反馈通路。

4 结语

大量研究显示，bcl-2家族和caspase家族在细胞凋亡转导通路尤其是线粒体途径中发挥了极为重要的调控作用。然而，对bcl-2、bax和caspase-3蛋白的认识还有待更进一步深入，目前，有关于caspase-3抑制剂、bcl-2及bax的激动剂和拮抗剂的研究也日益受到关注，这将有助于进一步明确二者在在细胞凋亡过程中的相互关系，揭示细胞凋亡的复杂的分子机制，并可能为凋亡相关疾病的治疗提供新的作用靶点，为设计出更有效的治疗手段提供重要的理论依据。

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