两种β-环糊精对苯环壬酯手性识别的串联四极杆质谱研究

刘治岐 王鸣刚* 刘 颖 李宇航 薛 明*

(1.兰州理工大学生命科学与工程学院，兰州730050;2.首都医科大学基础医学院药理系，北京100069)

苯环壬酯(phencynonate，PC)是中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所研制开发的抗M胆碱能受体Ⅰ类新药，本品不但具有较好的抗晕动病和治疗梅尼尔综合征的作用，而且还有预防治疗帕金森病和癫痫的作用［1-3］。苯环壬酯的化学结构为α－苯基－α－环戊基－α－羟基乙酸－9α－［N-甲基－3－氮杂双环(3，3，1)］壬酯，其化学结构上有一个手性碳，形成一对对映异构体。此对映异构体对M受体的立体选择性作用以及在动物体内的处置动力学与分布差异有统计学意义［4-5］。为了进一步对苯环壬酯及其异构体的药效学和代谢动力学提供合理的分子作用解释，本研究组以β-环糊精和2，3，6-三甲氧基-β-环糊精为主体分子，分别与客体分子苯环壬酯及其异构体混合形成非共价复合物，应用串联四级杆质谱法进行苯环壬酯手性分子与环糊精主体分子之间的手性识别和分子相互作用研究。

1 材料和方法

1.1 仪器与质谱条件

美国Waters公司生产的Quattro micro串联四级杆质谱仪，ESI源，鞘气为氮气，扫描方式为正离子扫描。毛细管电压3.5 kV，RF透镜电压0.3 V，源温度105℃，脱溶剂温度200℃，锥孔电压120 V，提取锥孔电压0.3 V，脱溶剂气大小350 L/h，锥孔气大小50 L/h。样品处理后直接进样。

1.2 试剂与样品制备

苯环壬酯消旋体及R/S对映体(phencynonate，PC，R/S-PC;Mr为357.3)由中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所提供，纯度＞99%，其化学结构式详见图 1。β-环糊精(β-cyclodenxxtrin，β-CD，Mr为 1 134.4)、2，3，6-三甲氧基-β-环糊精(2，3，6-tri-o-methl-βcyclodextrin，TM-β-CD，Mr为1 429.54)为美国Sigma公司产品。甲醇为色谱纯，美国Fisher公司产品。乙酸铵，北京化工厂产品。超纯水，杭州娃哈哈集团产品。

配制20 μmol/L的乙酸铵缓冲液。β-环糊精和2，3，6－三甲氧基-β-环糊精分别用纯净水重结晶后备用。用乙酸铵缓冲液分别配制成10 mmol/L的β-CD和TM-β-CD储备液。用甲醇配制成10 mmol/L苯环壬酯消旋体及单体储备液。量取1 mL的β-环糊精，分别与苯环壬酯及R/S对映体等体积混合，制成β-CD：PC(1：1)的混合液，超声30 min，避光静置12 h，调节pH至4.0～4.5之间。

同样条件配制TM-β-CD与PC的R和S单体1：1混合液。

图1 苯环壬酯及其对映异构体化学结构式Fig.1 Chemical structure of phencynonate isomersA：Rac-phencynonate;B：R-phencynonate isomer;C：S-phencynonate isomer.

2 结果与分析

2.1 环糊精与苯环壬酯的非共价键结合

电压为120 V时，在苯环壬酯的浓度高于β-环糊精的条件下，β-环糊精(Mr为1 134.4)有类似冠醚的结构性质，其易捕捉Na+，其加合物［M+Na］+峰为1 156.9［3］。苯环壬酯(相对分子量为357)的［M+H］+峰为358.3，与理论值相符合。苯环壬酯的断裂碎片苯基环戊基羟基乙酸与N-甲基－3－氮杂双环［3，3，1］壬－9a中间的酯氧键有碎片峰m/ z 156.2［M-202］+，这与文献［1］报道的结果相符合，且存在［PC+(β-CD)］+m/z 1 492.7的结合峰，说明β-CD与苯环壬酯之间存在着非共价键的相互作用，可通过范德华力和/或氢键作用进行包结，从而形成超分子体系，这是分子识别的基础［6-7］，详见图2。

2.2 β-环糊精对苯环壬酯对映体的手性识别作用

有研究［8］表明，由于环糊精具有特殊的内疏水与外亲水的空腔结构，一般能够对不同的手性分子产生立体选择性识别作用。在电压为120 V，扫描区间为m/z 1 100～1 600，分子的摩尔比为1：1的条件下，β-环糊精分别与苯环壬酯的R异构体和S异构体结合的质谱图详见图3，其中1 157的峰为环糊精捕捉Na+的结合峰，1 492的峰分别为R，S型PC与环糊精相互作用形成包合物的峰。

环糊精与苯环壬酯的手性识别率用R表示［8］，则：

其中，［CD+PC］表示复合物的峰强度;［CD］表示环糊精的峰强度;Rr、Rs表示环糊精对苯环壬酯异构体的非共价结合率，r和s分别表示苯环壬酯异构体R-PC和S-PC。分别计算图3中β-环糊精与苯环壬酯对映体的非共价键结合率，结果详见表1。

表1 苯环壬酯R/S异构体与β-CD的手性结合常数测定值Tab.1 The measured values of chiral binding constants between phencynonate R/S isomer and β-CD

由上表可知，苯环壬酯R构型的Rr与苯环壬酯S构型的 RS值比较接近，两者的比值 Rchiral为1.102。Rchiral和1相差越大，说明手性识别的效果越好，若Rchiral=1，说明基本没有手性识别效果［9］。因此，β-环糊精与苯环壬酯的对映异构体的立体识别能力有限。

2.3 2，3，6-三甲氧基-β-环糊精对苯环壬酯对映体的手性识别作用

2，3，6－三甲氧基-β-环糊精是一种改善β-环糊精溶解性和包合复合型的衍生物，其是一种对2，3，6位上的羟基全部进行甲氧基化的环糊精，其仍具有环糊精的内疏水与外亲水的空腔结构，与β-环糊精相比，TM-β-CD不仅具有较好的水溶性，而且在许多情况下对疏水性客体有更强的包结作用和手性识别能力［10］。在电压为120 V，扫描区间为650～1950 m/z，摩尔比为1：1的条件下，TM-β-CD分别与苯环壬酯的R异构体和S异构体结合的质谱图详见图4。由于TM-β-CD是β-CD的衍生物，仍易捕捉Na+，形成［M +Na］+峰为1 451，且拥有［PC+(TM-β-CD)］+m/z 1 787的结合峰，分析质谱图说明TM-β-CD与苯环壬酯之间也明显存在着非共价键结合作用，且R型苯环壬酯与TM-β-CD的结合作用要比S型更好更完全，TM-β-CD对于手性药物苯环壬酯异构体具有良好的手性识别能力。

图4 R/S-苯环壬酯与TM-β环糊精结合物的质谱图Fig.4 The mass spectrum of complexes between TM-β-cyclodextrin and phencynonateA：R-phencynonate isomer conjugates;B：S-phencynonate isomer conjugates;PC：phencynonate; TM-β-CD：2，3，6-tri-o-methyl-β-cyclodextrin.

用2.2中的环糊精对苯环壬酯的手性识别率公式，计算TM-β-环糊精对苯环壬酯对映体的手性结合率，结果详见表2。

由表2可知，苯环壬酯R异构体的Rr与苯环壬酯S异构体的RS值差别较大，两者的比值Rchiral为3.349。因此，TM-β-环糊精对苯环壬酯的S异构体的手性识别能力很强。 产生这种变化的原因是由于两种环糊精结构上的差异。实际上，苯环壬酯S异构体对M受体的立体选择性作用强于R异构体，在药物处置上也具有明显优势［3-4］，这在一定程度上解释了苯环壬酯S异构体优势作用的分子机制。

表2 苯环壬酯R/S异构体与TM-β-CD的手性结合常数测定值Tab.2 The measured values of chiral binding constants between phencynonate R/S isomer and TM-β-CD

TM-β-环糊精缺少仲羟基间的氢键作用，与β-环糊精相比，TM-β-环糊精的筒形结构宽口的一端变得更宽，导致构成环糊精基本结构的葡萄糖糖元上的2，3位置距离增大［11-12］。当苯环壬酯异构体进入TM-β-环糊精内部时，位于端口的C-O单键的自然旋转受到了抑制。由于将羟基置换成甲氧基，破坏了环糊精原有的氢键平衡状态，由于氢键对于配位结合有较大的影响［13］，可知TM-β-环糊精与苯环壬酯之间是以疏水作用结合，并且拥有较强的键合能力［14］。

3 讨论

本研究用串联四级杆质谱法分别对β-环糊精和苯环壬酯及其异构体的结合与手性识别进行研究，结果表明，β-环糊精和苯环壬酯有结合作用，但β-环糊精对苯环壬酯不同异构体的手性识别能力有限。2，3，6－三甲氧基-β-环糊精对苯环壬酯异构体具有很好的立体选择性识别能力和不同的结合力，这可能是由于这种环糊精自身特定的空间构型及具有不同的活性基团决定的。2，3，6－三甲氧基-β-环糊精可以作为苯环壬酯及其衍生物异构体的有效识别剂，本研究为苯环壬酯与两种β-环糊精的手性识别研究提供了一定的科学依据。

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