基质金属蛋白酶-9在脑缺血中的研究进展①

徐虹，孙华

基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)是一组Zn2+依赖性蛋白酶，现已发现20多种，根据蛋白质结构可分为五大类，即基质溶解酶、胶原酶、明胶酶、膜型酶和其他不能分类的基质酶，其主要功能是降解和重塑细胞外基质(extracellular matrix,ECM)，在正常的胚胎发育和组织重塑等生理过程以及一些疾病的病理生理中起重要作用。通过降解ECM，MMPs可以对血脑屏障产生的损害，加重脑水肿和出血。MMPs家族可能参与神经系统疾病如多发性硬化、脑外伤、脑炎、脑膜炎、脑血管病变等多种疾病的病理过程。在脑缺血神经炎症时可因细胞因子等的刺激，基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)大量释放，进而在缺血局部浸润形成炎性反应，使血脑屏障通透性增高，并可能参与脑缺血后的继发性损伤[1]。MMP-9主要在内皮细胞、胶质细胞、神经元和白细胞表达，几乎能降解ECM中的各种蛋白成分，在脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia reperfusion injury)急性期加重血脑屏障破坏，参与脑水肿和脑出血的组织损伤过程[2]。组织型基质金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinase,TIMPs)为特异性的抑制因子，在一些生理和病理过程中，细胞分泌MMPs同时也分泌TIMPs，在体内与MMPs同步表达，二者以1∶1的形式构成复合体。因此各种TIMPs成为目前脑缺血再灌注损伤治疗的重要突破点。

1 MMP-9的来源和表达

1.1 MMP-9的来源 MMP-9分子量Mr 92×103，活性分子量为83 kDa，又称为明胶酶B，其基本结构包括信号肽区、N-末端前肽区、催化基团区、C-末端血红素结合蛋白样区和铰链区。一经合成即以无活性形式从细胞内分泌到细胞外，且主要由纤溶酶原激活物活化，最后在体内由特殊的蛋白酶切割而产生活性。相关研究从MMP-9阳性细胞的表达、MMP-9基因敲除大鼠等不同途径探讨MMP-9的可能来源，但是它的细胞来源始终没有被完全认识。

1.2 MMP-9在脑组织中的表达 目前研究提示脑实质成分如内皮细胞，胶质细胞或神经元都可表达MMP-9。相关研究显示，在脑缺血后1~3 d，MMP-9在缺血核心区(纹状体和皮层)表达增加，在脑缺血的急性期，MMP-9主要在内皮细胞表达，其次是在神经元和星形胶质细胞[1]。也有研究显示，因脑缺血再灌注损伤后的MMP-9不是局部产生的，可能是从循环中的细胞通过血液通路传递过来，中性粒细胞是MMP-9的主要来源[2]。支持这一观点的是，有学者用细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecular 1,ICAM-1)抗体阻止中性粒细胞对血管内皮细胞的粘附或诱导中性粒细胞减少症，结果表达95 kDa MMP-9的中性粒细胞数明显减少[3]。除此之外，体外实验表明，小胶质细胞也被认为参与脑缺血再灌注损伤，并且可能和脑缺血后出血转归有关[4]。另外，在脑缺血修复期(7~14 d)，和MMP-9共表达的星形胶质细胞和神经元还有可能参与了脑缺血的修复过程[1]。因此，从MMP-9的来源来看，目前的结论并不一致，结果的差异可能与体内及体外实验的差异、动物的年龄、细胞培养的条件(尤其是其他细胞基质蛋白如纤连蛋白、玻连蛋白等的存在)、是否能够排除内源性基质蛋白酶表达等因素相关。因此，最大程度地控制实验条件，从形态学、分子水平及蛋白水平多个角度探讨MMP-9的来源可能是今后研究的方向。

2 MMP-9表达的调控及基因多态性

2.1 MMP-9表达的调控机制 MMPs的表达和活性受到严格调控，主要在以下两个水平进行：①转录水平的调节：在MMPs的合成过程中，mRNA的表达受生长因子、细胞因子、激素等多种因素调节。白介素(IL)-1、肿瘤坏死因子(TNF)-α、血小板源性生长因子(PDGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)等促进MMPs合成，而转化生长因子(TGF)-β、地塞米松、干扰素(IFN)-γ、肝素等抑制MMPs合成；②酶原激活水平：一般认为MMPs以无活性酶原形式分泌，只有被活化才能降解ECM。MMPs的酶原活化机制主要有3个方面，分别为细胞内活化、被MT-MMPs(包括MMP-14、MMP-15、MMP-16)活化和逐级活化。目前研究结果表明，MMPs的活化机制可能为：在尿激酶-纤溶酶原活化剂或组织纤溶酶原活化剂催化下变成纤溶酶，纤溶酶可部分激活间质胶原酶和基质分解素。

2.2 MMP-9的基因多态性 人类MMP-9基因位于16q 11.2~13.1，全长7.7 kb，含13个外显子。已发现在MMP-9基因中存在多个序列变异，其中关于C-1562/T多态位点的研究报道较多。MMP-9c-1562T多态性是MMP-9基因转录启动子上游的1562处存在的C被T取代。因启动子是参与基因转录调控密切相关的调节序列，因此，这些多态性的发生可能直接影响到MMP-9基因的转录能力，这一推测目前已被一些研究证实。Zhang等发现MMP-9启动子的多态性与动脉粥样硬化的程度相关，因C等位基因可与转录抑制蛋白结合，而T等位基因可不与转录抑制蛋白结合，从而表现出更高的启动子活性，引起MMP-9基因转录增加[5]。因此，MMP-9的不同基因型有可能作为基因背景，决定了不同人群对于某些疾病具有不同的易感性和不同的临床特征。由于MMP-9的重要生物学作用及其基因的特殊位置，MMP-9的基因多态性与疾病之间的关系受到普遍重视。不同MMP-9基因型的个体在功能上还可能存在差异，国外已有学者开始对MMP-9的基因多态性与一些疾病的相关性进行研究，初步的研究结果表明，MMP-9的基因多态性与慢性阻塞性肺疾病、急性冠状动脉综合征等多种疾病的发生、发展具有一定的相关性。MMP-9启动子区还存在一个-90(CA)n的多态性。这个微卫星多态性在人群中以等位基因(CA)14最多见，其次为等位基因(CA)21、(CA)22和(CA)23。启动子活性体外实验表明，在成纤维细胞中，含(CA)14的启动子活性只有含(CA)23启动子的60%左右。

3 MMP-9与脑缺血

研究表明，动脉粥样硬化斑块内MMP-9表达增多，纤维成分大量降解，使斑块破溃，形成附壁血栓，容易脱落，导致脑缺血发生，免疫组化和原位杂交研究证实，斑块中巨噬细胞和血管平滑肌细胞内MMP-9及其mRNA表达明显增加。临床试验中，Loftus等将70例动脉内膜切除术患者分为4组(Ⅰ组无症状，Ⅱ组出现症状>6个月，Ⅲ组出现症状1~6个月，Ⅳ组1个月内出现症状)，对所取斑块行MMP-9的定量测定，结果显示，Ⅳ组MMP-9水平显著高于对照组[6]。Kalela等观察到血浆MMP-9水平与冠状动脉狭窄程度呈正相关，MMP-9水平越高，狭窄越重，提示血浆MMP-9可作为动脉粥样硬化及脑梗死等病情活跃的标志物及随访指标[7]。动物研究表明，MMP-9的表达在局灶性脑缺血模型中24~48 h到达高峰[8]。在永久性大鼠脑缺血模型中，MMP-9的表达呈双峰型，即在10~15 h及24 h达到高峰。过去的研究多在1周范围内研究MMP-9的表达情况，通常认为MMP-9在脑缺血损伤中的作用是负面的。同时，血浆中MMP-9在脑缺血再灌注损伤后1 h也有升高[9]。最近，有文章探讨MMP-9在7~14 d内表达的情况，发现MMP-9在7~14 d可以出现另外一个高峰，而且表达的区域也由梗死核心区转移到缺血周围地带，提示这可能与MMP-9参与脑缺血后神经损伤功能的修复有关[2]。与此符合的是，我们之前研究结果表明I/R后脑组织中MMP-9的表达成双峰形表达(第1峰在48 h，第2峰在144 h)[10]。因此目前研究证实：①MMP-9和脑缺血关系十分密切，脑缺血再灌注损伤发生的急性期(数小时至48 h)和恢复期(7~14 d)，MMP-9在脑缺血区域(缺血皮质和纹状体)出现升高，其表达有可能呈现双峰形态，第1个峰值可能与急性期损伤相关，第2个峰值则可能参与了组织的修复过程；②不仅在缺血脑组织局部MMP-9表达，在独立于血脑屏障的外周血中，MMP-9也有轻微的表达；③MMP-9的表达量和动物神经功能、脑梗死的严重程度等呈正相关。

4 MMP-9与出血转归

脑缺血后的溶栓治疗是目前急性脑缺血的治疗措施之一。但是溶栓治疗长期以来受人质疑的一个原因是其会增加随后脑出血的风险。MMP-9被认为参与溶栓治疗后脑出血及脑水肿的病理过程。脑缺血发生后，溶栓治疗的患者可激活内源性及外源性的纤溶酶原激活物(tPA)，tPA可能通过LDL受体介导的蛋白通路(LDL receptor related protein,LRP)及蛋白激酶激活受体通路(proteinase activated receptor 1,PAR1)使MMP-9表达升高，从而加重脑缺血损伤、神经死亡及血脑屏障破坏的程度[11]。Castellanos等发现脑梗死出血转化患者血浆MMP-9浓度明显高于未继发出血患者，因此认为血浆MMP-9水平增高与急性脑梗死出血转化的发生密切相关[12]。Montaner等检测了39例心源性卒中患者血清MMP-9水平，根据CT检查结果，将出血转化分为出血性梗死和实质性血肿，结果发现MMP-9水平与迟发性出血转化有关，且是唯一的预测因子，实质血肿组MMP-9在24 h时达高峰[13]。据此他们认为，MMP-9水平可预测迟发性出血转化的发生，24 h时MMP-9水平增高往往预示着会出现血肿。同时，动物实验研究证明，在小鼠脑出血模型中，若在野生型小鼠纹状体内注射MMP-9基因敲除小鼠的血液，就可以明显缓解脑出血的症状[14]，且MMP-9基因敲除的小鼠在早期的脑缺血再灌注损伤中出血转化的发生率较野生型小鼠低[15]。但也有不一致的结论，脑缺血后应用重组纤溶酶原激活物(Recombinant tissue plasminogen activator,r-tPA)的副作用(血脑屏障的破坏等)也可能与MMP-9无关[16]。从目前研究来看，无论是临床还是实验研究均支持MMP-9水平可以反映脑缺血损伤后出血转归的可能性。

5 MMP-9及其抑制剂

MMP-9只有在解朊后才能在脑缺血再灌注损伤中发挥损伤作用，实验研究发现，可以通过人为因素在转录、激活、切割以及抑制等水平调节其活动。目前研究较多的是其抑制剂。目前发现的金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP)分4型：TIMP-l、TIMP-2、TIMP-3、TIMP-4。TIMP以1∶1的化学计量关系与活化的MMPs结合，抑制其话性。在TIMP与MMPs之间存在一定程度的抑制特异性。TIMP-1抑制大多数MMPs的活性，但不包括MMP-2；TIMP-2也是大多数MMPs抑制因子，但是不包 括 MMP-9； TIMP-3 抑 制 MMP-1， MMP-2， MMP-3，MMP-9，MMP-13的活性。脑缺血和(或)再灌注时，MMP-9异常升高，破坏血脑屏障，参与血管源性脑水肿和出血转化的形成，MMP-9也可能成为稳定动脉粥样硬化斑块和防治卒中的新靶点。因此，人为地调节MMP-9和TIMP-1之间的平衡，减少MMP-9或增加TIMP-1的含量、功能和活性，或使用人工合成的TIMPs有望成为一种治疗缺血性脑血管病的新手段。

Mishiro等联合应用tPA和一种新型的广谱MMPs抑制剂研究脑缺血大鼠模型，结果表明，联合治疗可能通过对紧密连接蛋白(tight junction proteins,TJPs)的保护，减少应用tPA 7 d后大鼠的死亡率[17]。Liu等选用选择性的MMP-2/9抑制剂SB-3CT，说明其在脑缺血早期可以通过调节闭锁蛋白的降解和闭锁蛋白-5的重新分配减缓脑缺血损伤[18]。Kanazawa等研究发现血管内皮生长因子(vascular endothelial growth,VEGF)在脑缺血后表达升高，激活MMP-9，因此VEGF的抑制剂也可能成为减少脑水肿、神经损伤及减轻应用tPA后出血转化的新途径[19]。此外，促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)被发现在体内体外动物脑缺血模型中具有保护作用，但是到目前为止，机制不明。有学者研究在脑缺血中，调整信号分子Janus激酶2、信号转导和转录激活蛋白-3(signal transducers and activators of transcription protein-3,STAT-3)以及TIMP-1可能是红细胞生成素(EPO)诱导的神经保护作用的主要介质[20]。同时，也有相当的研究报道，可以通过干预炎症因素调节MMP-9的表达，最终减轻脑缺血再灌注损伤[21]。另外，自由基抑制剂、Rho激酶抑制剂、间断的颈内动脉生理盐水灌注等被认为可以通过降低MMP-9表达减轻脑缺血再灌注损伤[22-24]。但是也有报道称，MMP-9及其抑制剂在脑缺血中的作用可以是双向的，即既可以加重脑缺血损伤，也可能参与损伤的修复过程。因此多数文献支持，脑缺血再灌注损伤之后血脑屏障的损伤可由3个方面产生：①脑缺血后外源性的tPA；②损伤后产生的氧化应激产物，如氧自由基等；③血脑屏障降解酶类，如MMPs家族。大多数的研究者试图从MMPs的广谱或者非广谱的抑制剂、氧自由基拮抗剂以及tPA受体拮抗剂等方面保护血脑屏障。

6 小结与展望

综上所述，体内和体外实验均表明，MMP-9表达水平是反应脑缺血再灌注损伤后脑缺血损伤程度、脑梗死面积以及预后的一个重要指标。目前对MMP-9的干预还处在动物实验阶段，通过影响MMP-9的上游信号，找到有效干预MMP-9表达的方法，对脑缺血的实验研究及预防治疗具有重要意义。

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