快速老化小鼠SAMP8在阿尔茨海默病研究中的应用①

李延峥，李林，张兰

目前，全世界大概有3560万痴呆患者，而到2050年，痴呆人数会超过1.15亿。常见的痴呆类型包括阿尔茨海默病(Alzheimer's disease)、路易体痴呆(dementia with Lewy bodies)和前额叶痴呆。其中阿尔茨海默病是最常见的老年痴呆，是以认知功能障碍、记忆能力下降、皮层和海马神经元丢失为特点的神经变性病。阿尔茨海默病的病理特征是脑内出现老年斑伴有β-淀粉样蛋白(amyloid beta-peptides,Aβ)沉积，神经原纤维缠结，胆碱能神经元功能障碍，突触和树突棘减少[1]。散发型阿尔茨海默病构成阿尔茨海默病患者的绝大部分，散发型阿尔茨海默病患者常在60~70岁时发病，并随增龄出现发病率的升高。此外，另有少数为遗传相关的家族型阿尔茨海默病。这些阿尔茨海默病患者早期发病，并与一些遗传基因的突变相关，包括前体蛋白(APP)、tau和PS-1基因[2]。基于这些家族性基因突变培育出的众多的转基因小鼠模型是目前常用于阿尔茨海默病研究的动物模型。但这些转基因小鼠模型只在短期内表现出阿尔茨海默病的一些病理特征，并不能完全模拟阿尔茨海默病的自然发病过程，有其自身局限性。

SAMP8小鼠是由日本京都大学Takeda教授领导的实验室在1970年培育的[3]，前身是AKR/J系小鼠，以早期出现快速老化并伴有显著的学习和记忆能力障碍为特征，且随增龄而加重。众多的研究也表明，SAMP8小鼠存在胆碱能功能缺失、氧化应激损伤、膜脂质改变和生理节律紊乱。同时，SAMP8小鼠脑内过量产生APP、Aβ，并伴有磷酸化tau蛋白表达量的增加，这些均与阿尔茨海默病患者脑内的病理改变相一致。此外，SAMP8小鼠作为研究阿尔茨海默病的动物模型，具有其自身的独特优势[4]：①95%以上的阿尔茨海默病均为散发，SAMP8小鼠在研究晚发型阿尔茨海默病和年龄相关性阿尔茨海默病的散发病例方面具有显著的优势；②前期研究表明，SAMP8小鼠脑内有年龄相关性APP的表达增加和Aβ样斑的形成；8月龄SAMP8小鼠脑内即出现可溶性Aβ的沉积，这与阿尔茨海默病患者早期轻度认知功能障碍(MCI)阶段的病理表现相似；而18月龄的SAMP8小鼠脑内可观察到Aβ淀粉样斑，表现为晚发型和年龄相关性Aβ淀粉样斑的形成，而这又与阿尔茨海默病患者晚期的病理表现相一致；③SAMP8小鼠脑内出现tau蛋白的异常磷酸化，可作为评价疗效的指标。基于SAMP8小鼠在阿尔茨海默病研究领域的重要地位，现就其近期的研究进展进行综述。

1 学习记忆功能障碍

最初的研究表明，与SAMR1小鼠相比，2月龄SAMP8小鼠即出现被动回避和单向刺激回避能力减低[5]。Morris水迷宫实验是一种让实验动物学习寻找水中隐蔽平台的操作过程，已成为一种研究动物空间学习和记忆的标准模式，能较准确地反映出动物的空间学习记忆能力。在Morris水迷宫中，SAMP8小鼠找到平台所需时间明显延长[6]。而在用于空间行为能力测试的八臂水迷宫中，SAMP8小鼠也表现出轻度的学习记忆功能缺陷[7]。可见，SAMP8小鼠是用来研究增龄性学习记忆障碍的一个有效的动物模型。

2 Aβ异常沉积

一般认为阿尔茨海默病的病因主要与Aβ的过量产生相关。淀粉状蛋白假说表明，Aβ能够通过激活GSK3β，促使tau蛋白磷酸化，进而形成神经原纤维缠结。此外，可溶性淀粉状蛋白还能够引起突触功能障碍及随之产生的认知功能缺陷[1]。Morley的研究团队通过应用不同的小鼠抗体，发现老年SAMP8小鼠脑内APP和Aβ蛋白水平显著增加[8]。Del Valle发现，6月龄SAMP8小鼠脑内海马区即有Aβ蛋白的异常沉积，这些沉积物中包含有Aβ1-40和Aβ1-42，以及其他Aβ的前体小片段，而作为对照组的SAMR1和ICR-CD1小鼠直到15月龄时才出现少量Aβ沉积，表明SAMP8小鼠在作为有关Aβ沉积方面的阿尔茨海默病发病机制的研究中具有很重要的价值[9]。此外，Manich等的近期研究表明，SAMP8小鼠脑内Aβ阳性颗粒与硫酸乙酰肝素糖蛋白(HSPG)阳性颗粒共表达，Aβ阳性颗粒处还可见到tau和MAP-2蛋白的表达[10]。现在的观点认为，Aβ在早发型阿尔茨海默病患者的发病中起到关键性作用。近来提出的以Aβ为靶点的被动免疫疗法被视为是阿尔茨海默病免疫治疗的一种新方法。研究通过应用Aβ1-42的单克隆抗体A8被动免疫SAMP8小鼠，能够提高SAMP8小鼠的学习记忆功能，减少脑内Aβ和tau蛋白磷酸化水平[11]。

3 tau蛋白高度磷酸化

tau蛋白是一种低分子量的微管相关蛋白，在稳定微管结构和诱导微管聚集方面起到关键性作用。tau蛋白的异常磷酸化，能够显著地降低微管稳定性，促使微管解聚。tau蛋白聚集成双螺旋的结构，参与阿尔茨海默病患者脑内神经原纤维的形成。Cdk5和GSK3β被认为是导致tau蛋白异常高度磷酸化的关键激酶[12]。曾有研究表明，5月龄SAMP8小鼠脑内即出现tau蛋白(Ser404，Thr205位点)高度磷酸化，且与Cdk5/p25通路的活性增加相关，而与Akt/GSK3β通路的活性无关[13]。近期一项有关昔多芬(sildenafil)的药物研究中发现，9月龄的SAMP8小鼠的Akt/GSK3β通路活性增加，同时伴有tau蛋白(Ser396，Ser404位点)磷酸化水平增加[14]。

4 神经递质改变

早期认为，胆碱能神经功能缺失是阿尔茨海默病发病的重要原因之一。这使得众多的药物研发以改善阿尔茨海默病患者脑内胆碱能神经元功能为靶点。SAMP8小鼠脑内乙酰胆碱酯酶乙酰基转移酶活性降低，而乙酰胆碱酯酶的活性并无明显改变，但是丁基胆碱酯酶(BuChE)的活性上升。阿尔茨海默病患者脑脊液内BuChE水平也是升高的[15]。10月龄SAMP8小鼠脑内兴奋性氨基酸释放增加，谷氨酸和谷氨酰胺水平升高[16]。6月龄SAMP8小鼠脑内N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)活性降低，乙酰胆碱释放减少[17]。NMDA受体激活能够使细胞钙离子内流增加，蛋白激酶C和钙调蛋白激酶激活，促使环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(CREB)磷酸化水平增加，参与与学习记忆相关的长时程增强效应(LTP)的形成。有研究表明，老年SAMP8小鼠脑内海马区NMDA受体结合能力降低，蛋白激酶C水平下降，CREB磷酸化水平降低，共同促使其学习记忆功能障碍[18-19]。

5 突触结构和功能障碍

在中枢神经系统中，突触承担着神经元间信息传递的重任，阿尔茨海默病患者记忆能力的降低与脑内突触的超微结构改变相关[20]。在突触部位的诸多结构因素中，突触后致密物质是一种非常敏感的易变参数，极易受突触前传入信息的状况及身体内外环境等众多因素的影响而发生变化。突触后致密物(postsynaptic dense,PSD)的形态变化也反映突触后膜上受体与离子通道的变化，在功能上影响突触传递的效率。老年SAMP8小鼠脑内突触相关蛋白PSD-95、MAP2和突触素表达水平降低，通过药物增加表达水平，能够显著改善学习记忆功能[21-22]。此外，SAMP8小鼠脑内海马区神经树突棘的密度有显著的下降，这也与阿尔茨海默病患者脑内的病理改变相一致[23-24]。

6 生理节律紊乱

SAMP8小鼠随增龄出现加速的生理节律改变。SAMP8小鼠活动性的增加往往出现在睡眠状态下，这与阿尔茨海默病的生理节律紊乱、夜间活动性增加相一致[25]。褪黑素能够同时改善SAMP8小鼠和阿尔茨海默病患者的生理节律紊乱[26]。SAMP8小鼠随增龄出现慢波睡眠增加伴潜伏期缩短，并伴有觉醒时限减少[27]。老年SAMP8小鼠反常睡眠更为常见，其睡眠时θ峰频率明显减慢，这种θ节律的降低能够通过损伤长时程增强效应进而造成与学习记忆密切相关的海马功能的损害。而在阿尔茨海默病患者疾病早期即可观察到睡眠时θ节律的改变[28]。SAMP8小鼠海马内视磺酸受体α和甲状腺激素结合蛋白水平降低，视黄酸受体激动剂能够增加SAMP8小鼠大脑皮层内乙酰胆碱的水平，进而缓解SAMP8小鼠所出现的快动眼睡眠时限的减少[29]。由此可见，SAMP8小鼠生理节律紊乱与其记忆受损之间可能存在着一定的联系。

7 基因表达改变

早老素-1是γ-分泌酶复合物的一个重要组成部分，其他组件包括nicastrin、APH-1和Pen-2。γ-分泌酶能够裂解淀粉样前体蛋白，通过γ-分泌酶的作用产生Aβ1-40和Aβ1-42小肽片段。通过对SAMP8小鼠脑内海马区早老素-1的研究发现，与CD-1鼠相比，SAMP8小鼠脑内海马区早老素-1的表达水平升高[30]。2000年，Kumar等发现，SAMP8小鼠脑内海马区的伴侣蛋白调节家族和一些代谢酶的基因表达发生改变[31]。其中，异代谢酶在抗氧化应激方面发挥着重要的作用，而伴侣蛋白信号复合物参与tau蛋白和淀粉样蛋白等异常蛋白沉积的病理过程[32]。Carter发现，趋化因子CCL19在老年SAMP8小鼠脑内海马区出现异常高的表达，这表明炎症在SAMP8小鼠的学习记忆功能损伤方面起促进作用[33]。

8 睾酮水平降低

老年男性随增龄出现睾酮水平的下降，在阿尔茨海默病的男性患者中，其睾酮水平更低。有研究发现，具有生物活性睾酮水平的降低，能够成为独立预测患者从轻度认知功能障碍向阿尔茨海默病发展的疾病进展阶段的一个有效指标[34]。12月龄SAMP8小鼠睾酮水平显著降低[35]。而通过睾酮替代疗法能够提高SAMP8小鼠的学习和记忆功能，减轻海马内皮细胞的老化。睾酮能够通过NAD+依赖的脱乙酰基酶SIRT1保护血管内皮细胞免受氧化应激的损伤，增加eNOS的水平，进而诱导SIRT1的表达。而SIRT1又通过上调eNOS的水平来抑制血管内皮的老化[36]。

9 血脑屏障破坏

近期有研究表明，12月龄SAMP8小鼠血脑屏障(BBB)破坏明显，血管壁有大量的淀粉样物质沉积，推测这些淀粉样沉积物可能导致BBB的破坏[37]。进入大脑的淀粉样前体蛋白的运输是依赖于先进糖化终产物受体(RAGE)和溢出转运受体(低密度脂蛋白受体，LDLR)的水平。与SAMR1相比，SAMP8小鼠脑内RAGE和LDLR的表达水平均升高[38]。Aβ溢出被认为是阿尔茨海默病患者脑内Aβ增加的一个重要机制，而老年SAMP8小鼠脑内Aβ1-40和Aβ1-42溢出明显增加[39]。这些研究表明，SAMP8小鼠脑内BBB的破坏可能与Aβ的运输改变相关，并造成脑内氧化应激水平的升高，进而促使其出现学习记忆功能障碍。

综上所述，SAMP8小鼠是与阿尔茨海默病病理过程极为相似的动物模型，它在早期即出现学习记忆功能障碍，Aβ异常沉积，tau蛋白磷酸化，神经递质改变，突触结构和功能障碍，生理节律紊乱，以及基因表达等多方面的特征性改变，而这些改变的出现与人类阿尔茨海默病相一致。因此，SAMP8小鼠是用来研究阿尔茨海默病及其相关药物研发的一个很有价值的动物模型。

[1]Morley JE.Alzheimer's disease:future treatments[J].J Am Med DirAssoc,2011,12(1):1-7.

[2]Alzheimer's Association,Thies W,Bleiler L.2011 Alzheimer's disease facts and figures[J].Alzheimers Dement,2011,7(2):208-244.

[3]Takeda T,Josokawa M,Takeshita S,et al.A new murine model accelerated senescence[J].Mech Ageing Dev,1981,17(2):183-194.

[4]Pallas M,Camins A,Smith MA,et al.From aging to Alzheimer's disease:unveiling"the switch"with the senescence-accelerated mouse model(SAMP8)[J].J Alzheimers Dis,2008,15(4):615-624.

[5]Flood FJ,Morley JE.Learning and memory in the SAMP8 mouse[J].Neurosci Biobehav Rev,1998,22:1-20.

[6]Markowska A,Spangler EL,Ingram DK.Behavioral assessment senescence-accelerated mouse(SAMP8 and R1)[J].Physiol Behav,1998,64:15-26.

[7]Miyamoto M.Characteristics of age-related behavioral changes in senescence-accelerated mouse SAMP8 and SAMP10[J].Exp Gerontol,1997,32:139-148.

[8]Morley JE,Kumar VB,Bernardo AE,et al.Beta-amyloid precursor polypeptide in SAMP8 mice affects learning and memory[J].Peptides,2000,21(12):1761-1767.

[9]Del Valle J,Duran-Vilaregut J,Manich G,et al.Early amyloid accumulation in the hippocampus of SAMP8 mice[J].J Alzheimers Dis,2010,19(4):1303-1315.

[10]Manich G,Mercader C,del Valle J,et al.Characterization of amyloid-beta granules in the hippocampus of SAMP8 mice[J].JAlzheimers Dis,2011,25(3):535-546.

[11]Zhang Y,He JS,Wang X,et al.Administration of amyloid-beta 42 oligomer-specific monoclonal antibody improved memory performance in SAMP8 mice[J].J Alzheimers Dis,2011,23(3):551-561.

[12]Plattner F,Angelo M,Giese KP.The roles of cyclin-dependent kinase 5 and glycogen synthase kinase 3 in tau hyperphosphorylation[J].J Biol Chem,2006,281(35):25457-25465.

[13]Canudas AM,Gutierrez-Cuesta J,Rodriguez MI,et al.Hyperphosphorylation of microtubule-associated protein tau in senescence-accelerated mouse(SAM)[J].Mech Ageing Dev,2005,126(12):1300-1304.

[14]Orejana L,Barros-Minones L,Jordan J,et al.Sildenafil ameliorates cognitive deficits and tau pathology in a senescenceaccelerated mouse model[J].Neurobiol Aging,2012,33(3):625.e11-20.

[15]Fernandez-Gomez FJ,Munoz-Delgado E,Montenegro MF,et al.Cholinesterase activity in brain of senescence-accelerated-resistance mouse SAMR1 and its variation in brain of senescence-accelerated-prone mouse SAMP8[J].J Neurosci Res,2010,88(1):155-166.

[16]Kitamura Y,Zhao XH,Ohnuki T,et al.Age-related changes in transmitter glutamate and NMDA receptor/channels in the brain of senescence-accelerated mouse[J].Neurosci Lett,1992,137(2):169-172.

[17]Zhao XH,Kitamura Y,Nomura Y.Age-related changes in NMDA-induced[3H]acetylcholine release from brain slices of senescence-accelerated mouse[J].Int J Dev Neurosci,1992,10(2):121-129.

[18]Tomobe K,Okuma Y,Nomura Y.Impairment of CREB phosphorylation in the hippocampal CA1 region of the senescence-accelerated mouse(SAM)P8[J].Brain Res,2007,1141:214-217.

[19]Zhang GR,Cheng XR,Zhou WX,et al.Age-related expression of calcium/calmodulin-dependent protein kinase II A in the hippocampus and cerebral cortex of senescence accelerated mouse prone/8 mice is modulated by anti-Alzheimer's disease drugs[J].Neuroscience,2009,159(1):308-315.

[20]Bertoni-Freddari C,Fattoretti P,Casoli T,et al.Morphological adaptive response of the synaptic junctional zones in the human dentate gyrus during aging and Alzheimer's disease[J].Brain Res,1990,517(1-2):69-75.

[21]Lee YA,Cho EJ,Yokozawa T.Oligomeric proanthocyanidins improve memory and enhance phosphorylation of vascular endothelial growth factor receptor-2 in senescence-accelerated mouse prone/8[J].Br J Nutr,2010,103(4):479-489.

[22]Li Q,Zhao HF,Zhang ZF,et al.Long-term green tea catechin administration prevents spatial learning and memory impairment in senescence-accelerated mouse prone-8 mice by decreasing A beta 1-42 oligomers and upregulating synaptic plasticity-related proteins in the hippocampus[J].Neuroscience,2009,163(3):741-749.

[23]Sugiyama H,Akiyama H,Akiguchi I,et al.Loss of dendritic spines in hippocampal CA1 pyramidal cells in senescence accelerated mouse(SAM)—a quantitative Golgi study[J].Rinsho Shinkeigaku,1987,27(7):841-845.

[24]Knobloch M,Mansuy IM.Dendritic spine loss and synaptic alterations in Alzheimer's disease[J].Mol Neurobiol,2008,37(1):73-82.

[25]Pang KC,Miller JP,McAuley JD.Circadian rhythms in SAMP8:a longitudinal study of the effects of age and experience[J].NeurobiolAging,2004,25(1):111-123.

[26]Caballero B,Vega-Naredo I,Sierra V,et al.Favorable effects of a prolonged treatment with melatonin on the level of oxidative damage and neurodegeneration in senescence-accelerated mice[J].J Pineal Res,2008,45(3):302-311.

[27]Colas D,Cespuglio R,Sarda N.Sleep wake profile and EEG spectralpowerin young orold senescence accelerated mice[J].NeurobiolAging,2005,26(2):265-273.

[28]Montez T,Poil SS,Jones BF,et al.Altered temporal correlations in parietal alpha and prefrontal theta oscillations in early-stage Alzheimer disease[J].Proc Natl Acad Sci USA,2009,106(5):1614-1619.

[29]Kitaoka K,Sano A,Chikahisa S,et al.Disturbance of rapid eye movement sleep in senescence-accelerated mouse prone/8 mice is improved by retinoic acid receptor agonist Am80(Tamibarotene)[J].Neuroscience,2010,167(3):573-582.

[30]Kumar VB,Franko M,Banks WA,et al.Increase in presenilin 1(PS1)levels in senescence-accelerated mice(SAMP8)may indirectly impair memory by affecting amyloid precursor protein(APP)processing[J].J Exp Biol,2009,212(Pt 4):494-498.

[31]Kumar VB,Franko MW,Farr SA,et al.Identification of age-dependent changes in expression of senescence-accelerated mouse(SAMP8)hippocampal proteins by expression array analysis[J].Biochem Biophy Res Commun,2000,272(3):657-661.

[32]Koren J 3rd,Jinwal UK,Lee DC,et al.Chaperone signaling complexes in Alzheimer's disease[J].J Cell Mol Med,2009,13(4):619-630.

[33]Carter TA,Greenhall JA,Yoshida S,et al.Mechanisms of aging in senescence-accelerated mice[J].Genome Biol,2005,6(6):R48.

[34]Chu LW,Tam S,Wong RL,et al.Bioavailable testosterone predicts a lower risk of Alzheimer's disease in older men[J].J Alzheimers Dis,2010,21(4):1335-1345.

[35]Flood JF,Farr SA,Kaiser FE,et al.Age-related decrease of plasma testosterone in SAMP8 mice:replacement improves age-related impairment of learning and memory[J].Physiol Behavior,1995,57(4):669-673.

[36]Ota H,Akishita M,Akiyoshi T,et al.Testosterone deficiency accelerates neuronal and vascular aging of SAMP8 mice:protective role of eNOS and SIRT1[J].PLoS One,2012,7(1):e29598.

[37]del Valle J,Duran-Vilaregut J,Manich G,et al.Cerebral amyloid angiopathy,blood-brain barrier disruption and amyloid accumulation in SAMP8 mice[J].Neurodegener Dis,2011,8(6):421-429.

[38]Wu B,Ueno M,Onodera M,et al.RAGE,LDL receptor,and LRP1 expression in the brains of SAMP8[J].Neurosci Lett,2009,461(2):100-105.

[39]Banks WA,Robinson SM,Verma S,et al.Efflux of human and mouse amyloid beta proteins 1-40 and 1-42 from brain:impairment in a mouse model of Alzheimer's disease[J].Neuroscience,2003,121(2):487-492.