风湿免疫临床实验的实习教学体会

张文兰 胡同平 (包头医学院第一附属医院，包头014010)

风湿免疫病学是一门较新的临床医学学科，起步较晚，人们对风湿免疫性疾病的认识尚浅，易引起漏诊、误诊。风湿免疫性疾病指主要侵犯关节、肌肉、骨骼及关节周围的软组织，如肌腱、韧带、滑囊、筋膜等部位的病。在临床实验的实习带教中，笔者认为应从以下四个方面让学生对风湿免疫有更全面的了解。

1 要让学生了解风湿免疫性疾病的范畴和分类[1]

风湿免疫性疾病是一组疾病，包括弥漫性结缔组织病(类风湿关节炎、红斑狼疮、硬皮病、多肌炎、重叠综合征、血管炎等)、脊柱关节病(强直性脊柱炎、Reiter综合征、银屑病关节炎、未分化脊柱关节病等)、退行性变如原发性和/或继发性骨关节炎、与代谢和内分泌相关的风湿病(痛风、假性痛风、马方综合征、免疫缺陷病等)、和感染相关的风湿病(反应性关节炎、风湿热等)、肿瘤相关的风湿病(原发性的滑膜瘤、滑膜肉瘤等，继发性的多发性骨髓瘤、转移瘤等)、神经血管疾病(神经性关节病、周围神经受压和/或神经根受压等引起的压迫性神经病变、雷诺病等)、骨与软骨病变(骨质疏松、骨软化、肥大性骨关节病、弥漫性原发性骨肥厚、骨炎等)、非关节性风湿病(关节周围病变、椎间盘病变、特发性腰痛、其他痛综合征如精神性风湿病等)、其他有关关节症状的疾病如周期性风湿病、间歇性关节积液、药物相关的风湿综合征、慢性活动性肝炎等。

2 要让学生对风湿免疫性疾病的自身抗体有全面的了解

随着医学的不断发展和进步，出现了越来越多的自身抗体。这些自身抗体的出现，对于风湿免疫性疾病的诊断和鉴别诊断，起到了非常重要的作用。

2.1 抗核抗体 抗核抗体(Antinuclear antibodies，ANA)是抗细胞核抗原成分的自身抗体的总称，是一组针对细胞核内DNA、RNA、蛋白质、脂类、酶类或这些物质的分子复合物的抗体。已证实，ANA对很多自身免疫性疾病有诊断价值。在不同疾病中，特别是风湿免疫性疾病，其抗体谱有一定的特异性。在炎症性风湿病中ANA阳性率在20% ～100%，其中类风湿关节炎中ANA阳性率最低，为20% ～40%[2]。因而，检测ANA对于不同类型风湿病意义重大[3]。目前，ANA检测已成为临床上的一个极重要的自身免疫病的筛查实验。

2.2 类风湿关节炎相关免疫标志物 用于诊断类风湿关节炎，除了传统的类风湿因子外，最近几年，又出现了抗环瓜氨酸肽抗体(CCP)、抗核周因子(APF)、抗角蛋白抗体(AKA)、抗RA33抗体、抗突变型瓜氨酸波形蛋白抗体(MCV)等更敏感、更特异的诊断指标。

2.3 系统性红斑狼疮相关免疫标志物 抗双链DNA抗体、抗单链DNA抗体、抗Sm抗体、抗组蛋白抗体、抗核小体抗体对于SLE的诊断和鉴别诊断也起到了非常重要的作用，特别是抗核糖体P蛋白抗体对于狼疮脑病诊断有非常高的特异性。

2.4 干燥综合征(Sjögren’s syndrome，SS)相关免疫标志物 SS是常见的自身免疫紊乱疾病，它的特征是泪腺和唾液腺的淋巴细胞浸润，导致角膜结膜炎和口腔干燥。尽管对SS的分类、症状、眼睛和口的干燥程度已有较完善的诊断标准，但结果并不理想。另外，对眼泪和唾液的测定缺乏灵敏度和特异性，即使是口腔唾液腺的活组织检查，灵敏度也只有80%。而抗α-胞衬蛋白(α-fodrin)多肽抗体是从人类SS模型NFS/sld小鼠唇腺中提取的涎腺特异性自身抗体，是一种与细胞架构有关的细胞内蛋白，被认定为SS的敏感的和特异的标记物[4]。

2.5 其他自身抗体 皮肌炎、多肌炎和包涵体肌炎都是原发性、未知病因学的炎症疾病，具有肌无力和近端肌肉组织萎缩的特征。而抗JO-1抗体、抗PMScl-100抗体、抗PL-7抗体、抗PL-12抗体、抗Mi-2抗体、抗Ku(p78/80)抗体、抗SRP抗体等这些肌炎特异性自身抗体和肌炎相关性自身抗体的检测，对于肌炎的诊断和鉴别诊断起到了画龙点睛的作用。

因此，让学生全面了解各种疾病的特异性和相关性自身抗体是非常必要的。

3 要让学生对常见自身抗体的检测方法有所了解

因为是临床实验的实习，所以各种实验的检测原理和检测方法是学生们要重点掌握的内容。从上面的内容可以看出，风湿免疫性疾病种类很多，用于风湿免疫性疾病的诊断和鉴别诊断的自身抗体也有很多。从我们科风湿免疫实验室现在已经开展的项目来看，检测方法归纳起来主要有以下四种。

3.1 间接免疫荧光法(Indirect Immunofluorescence，IIF) 用特异性抗体与标本中相应抗原反应，再用荧光素标记的第二抗体(抗抗体)与抗原抗体复合物中第一抗体结合，洗涤后在荧光显微镜下观察特异性荧光，以检测未知抗原或抗体。本实验室主要用于 ANA、APF、AKA和抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)的检测。其优点是形象、直观，一目了然地观察结果，但缺点是只能定性，或者半定量，而且结果容易受观察者主观因素的影响。

3.2 酶联免疫吸附试验法(Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA)[5]其基本原理是把抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性;并将抗原或抗体与某种酶连接成酶标记抗原或抗体，它既保留了免疫活性，又保留了酶的活性;测定时将受检样品(含待检抗原或抗体)和酶标记抗原或抗体按一定程序与结合在固相载体上的抗原或抗体反应形成抗原抗体复合物;用洗涤的方法将固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例;加入底物后，底物被固相载体上的酶催化变成有色产物，通过定性或定量检测有色产物量即可确定样品中待测物质含量。由于酶催化效率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的灵敏度。本实验室开展的类风湿因子分型(RF-IgA/G/M)、抗环瓜氨酸肽抗体(CCP)、抗RA33抗体、抗dsDNA抗体、抗核小体抗体、抗线粒体抗体M2型、抗α-胞衬蛋白多肽抗体都是采用的ELISA法，而且都是定量检测。

3.3 免疫印迹法(Immunoblot Test，IBT) 是在蛋白质电泳分离和抗原抗体检测的基础上发展起来的一项检测蛋白质的技术，将SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的高分辨力与抗原抗体反应的高特异性相结合。临床上抗核提取物抗体(ENA)的测定最常使用的方法就是IBT。

3.4 速率散射比浊法(Rate Nephelometry) 是抗原抗体结合反应的动力学测定法。所谓速率是指抗原抗体反应在单位时间内形成免疫复合物的量，连续测定各单位时间内复合物形成的速率与其产生的散射光信号联系在一起，形成动态的速率散射比浊法，每项检测仅1～2分钟即可完成。本实验室开展的免疫球蛋白(IgG、IgA、IgM、IgE、IgG4)、补体(C3、C4)、抗链球菌溶血素O、抗链球菌DNA酶、C-反应蛋白、类风湿因子的测定均使用西门子的BNP特种蛋白仪，采用速率散射比浊法全自动定量检测。操作简单，只需要将标本放入样品盘，在电脑上发出指令就行，并且能很快得到结果，能为临床提供及时、准确的报告。

4 要让学生熟悉实验的全程操作，让每位学生都亲自动手参与实验的每一个步骤与环节

学生对于实验的全过程有了深刻的了解，这样在今后的独立工作中，就可以把握好每一个实验环节，养成缜密的思维习惯，为他们以后完成自己的工作打好基础。在实验之前，要让学生明白一个基本思路，那就是免疫学检测技术的基础是抗原抗体反应。在实验过程中，要充分发挥学生的积极性和技巧性。每个人要独立完成实验，其目的是训练正确、熟练的操作能力，养成良好的工作习惯，遵守实验操作规程，认真观察实验结果，切忌走马观花。实验完成后，要认真总结实验过程中出现的问题，解答每一位学生提出的疑问，让每位学生都弄懂弄通免疫指标在临床诊断的重要意义，为以后工作中合理、正确地解答病人和临床医生的疑问打下良好的基础。

总之，通过风湿免疫临床实验的相关学习，让学生对风湿免疫性疾病的范畴和分类有更全面的了解，特别是对自身免疫性疾病常见的自身抗体及其检测方法和操作过程会有更直观、更直接、更感性的认识。不管学生以后是从事临床工作，还是从事实验室工作，相信这对他们以后的工作会有很大的帮助。

1 陆再英，钟南山.内科学[M].第7版.北京:人民卫生出版社，2008:842-845.

2 Fritsch C，Hoebeke J，Dali H et al．52-kDa Ro/SSA epitopes preferentially recognized by antibodies from mothers of children with neonatal lupus and congenital heart block[J].Arthritis Res Ther，2005;8(4):101-107.

3 Metskula K，Salur L，Mandel M et al．Demonstration of high prevalence of SS-A antibodies in a general population:association with HLA-DR and enterovirus antibodies[J].Immunol Lett，2006;10(6):14-18.

4 Turkcapar N，Olmez U，Tutkak H et al．The importance of alpha-Fodrin antibodies in the diagnosis of Sjögren’s syndrome[J].Rheumatol，2006;26(4):354-359.

5 王兰兰，吴健民.临床免疫学与检验[M].第4版.北京:人民卫生出版社，2008:103-104.