桃红四物汤对蛋白酶激活受体激活诱导血小板释放VEGF和Endostatin的影响

尹登科，杨晔，尹娟娟，韩岚，许钒，彭代银

(安徽中医学院药学院安徽省中药研究与开发重点实验室，安徽合肥230031)

桃红四物汤出自清·吴谦所著的《医宗金鉴》，由熟地、当归、白芍、川芎、桃仁、红花组成，是活血化瘀的代表方、基础方，主治血瘀之证。本课题组前期研究发现桃红四物汤醇提物对血瘀证大鼠模型表现出较好的活血化瘀作用［1］，对正常大鼠经二磷酸腺苷(ADP)和肾上腺素(Adr)诱导的血小板活化具有显著的抑制作用［2］。血小板可以通过多种信号途径被激活，但是凝血酶是最强的内源性血小板激动剂，凝血酶主要通过血小板表面的蛋白酶激活受体(proteinase activated receptors，PARs)活化血小板，人血小板表达PAR1和PAR4，PAR1或PAR4可通过不同的信号途径激活血小板，所产生的生理效应也不同。PAR1激活可促进血小板释放促血管生成因子，而PAR4激活诱导血管生成抑制因子的释放［3］。血小板活化对内皮细胞功能的影响是导致血瘀证的重要方面［4］，前期研究表明桃红四物汤含药血清具有促进内皮细胞增殖的作用［5］，本实验体外考察桃红四物汤对PAR1和PAR4诱导血小板聚集以及释放VEGF和endostatin的作用，为进一步阐明桃红四物汤治疗血瘀证打下基础。

1 材料与方法

1.1 药材与试剂熟地黄、白芍、当归、川芎、桃仁、红花购自安徽安保药业有限公司，并经安徽中医学院中药与资源教研室鉴定。健康无菌脐带由安徽医科大学第一附属医院妇产科提供。凝血酶(10 U/mg，Ruibio)，PAR1-AP(SFLLRN-NH2)和PAR4(AYPGKF-NH2)由上海强耀生物科技有限公司合成，纯度＞98%;人血管内皮生长因子ELISA试剂盒、人内皮抑素ELISA试剂盒，购自合肥博美生物技术公司;M199培养基(美国Gibco公司)。

1.2 桃红四物汤醇提物的制备将熟地黄4 g，白芍3 g、当归3 g、川芎2 g、桃仁3 g、红花2 g加入10倍量(V/W)75%乙醇(V/V)回流提取2 h，滤液采用旋转蒸发仪挥发至干，加入DMSO溶解，然后在15 000×g离心15 min，取上清(1 mL相当于原药材2.5 g)，－20℃保存。使用前用生理盐水稀释至1 mL相当用于原药材25 mg。

1.3 富血小板血浆的制备取近两周未服用阿司匹林或其非甾体抗炎药物健康人血20 mL，和3.8%枸橼酸钠(8∶1 V/V)混合均匀。室温条件下200×g离心20 min，小心吸取上清即得富血小板血浆(PRP)。取部分富血小板血浆在400×g离心15 min，取上清为贫血小板血浆(PPP)，用贫血小板血浆调富血小板血浆至2.5×108mL－1。

1.4 血小板聚集实验取0.4 mL富血小板血浆(2.5×108mL－1)，加入不同体积的桃红四物汤(8、20、40 μL)至终质量浓度为0.5～2.5 mg/mL，同时设置0.1%(V/V)DMSO对照，37℃，500 r/min孵育5 min，再加入PAR1-AP(10 μmol/L)或PAR4-AP(200 μmol/L)或凝血酶(1 U/mL)，以贫血小板血浆调零，记录5 min内吸光值变化情况。

1.5 血小板释放VEGF和Endostatin取0.4 mL富血小板血浆(2.5×108mL－1)，加入桃红四物汤至终质量浓度为2.5 mg/mL，同时设置0.1%DMSO对照，37℃，500 r/min孵育5 min，再加入PAR1-AP(10 μmol/L)或PAR4-AP(200 μmol/L)或凝血酶(1 U/mL)孵育5 min，10 000 r/min，4℃离心15 min，上清－20℃保存，ELISA法测定VEGF和Endostatin。

1.6 血小板分泌液的制备取5 mL富血小板血浆与桃红四物汤(2.5 mg/mL)或对照0.1%DMSO 37℃，500 r/min振荡孵育5 min，每组平均分成4份，分别加入PAR1-AP(10 μmol/L)或PAR4-AP(200 μmol/L)或凝血酶(1 U/mL)或空白(生理盐水)，使终体积相等，37℃孵育5 min;10 000 r/min，4℃离心15 min，上清立即用于内皮细胞增殖实验。

1.7 血小板释放液对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的作用人脐静脉内皮细胞(HUVECs)采用文献报道的方法在体外分离培养［6］，HUVECs经胰酶消化，收集细胞接种于含有1%明胶包被的96孔板中，细胞数为2×104个/mL，每孔200 μL，培养24 h后，换1%FBS的M199培养液培养24 h，小心移去培养基，加入含1%FBS的M199培养基180 μL和血小板分泌液20 μL，培养48 h后，每孔加入20 μL 5 mg/mL MTT，孵育4 h后弃去培养基，加入200 μL DMSO，振荡10 min后，酶标仪测定490 nm的吸光值。

2 结果

2.1 桃红四物汤对PAR1-AP和PAR4-AP诱导血小板聚集的作用PAR1-AP(10 μmol/L)和PAR4-AP(200 μmol/L)均可以显著的诱导人血小板聚集，其中PAR1-AP可诱导血小板最大聚集率达到82%±8.3%，桃红四物汤(0.5～2.5 mg/mL)可剂量依赖性的抑制PAR1-AP和凝血酶诱导的血小板聚集。但是对PAR4-AP诱导的血小板聚集没有显著的抑制作用(表1)。这些结果表明桃红四物汤可选择性的抑制PAR1-AP诱导的血小板聚集。

表1 对PAR1-AP和PAR4-AP诱导血小板聚集的抑制作用±s，n=4)Tab.1 Effect of Taohong Siwu Decootion on PAR1-AP and PAR4-AP induced platelet aggregation ±s，n=4)

表1 对PAR1-AP和PAR4-AP诱导血小板聚集的抑制作用±s，n=4)Tab.1 Effect of Taohong Siwu Decootion on PAR1-AP and PAR4-AP induced platelet aggregation ±s，n=4)

注:同0.1%DMSO组比较，*P＜0.05，＊＊P＜0.01。

组别质量浓度/(mg·mL－1)聚集率%PAR1-AP/(10 μmol·L－1)PAR4-AP/(200 μmol·L－1)Thrombin/(1 U·mL－1)0.1%DMSO82.4±8.375.2±5.878.4±6.7桃红四物汤0.577.1±6.973.6±4.973.1±7.5桃红四物汤1.2558.6±7.2*72.2±5.259.9±6.2*桃红四物汤2.521.5±6.3＊＊69.7±6.932.3±5.8＊＊

2.2 桃红四物汤对PAR1-AP，PAR4-AP和凝血酶诱导血小板释放VEGF和Endostatin的影响凝血酶(1 U/mL)对人血小板分泌VEGF和endostatin没有显著影响，但是PAR1-AP(10 μmol/L)可诱导血小板VGEF释放，PAR4-AP(200 μmol/L)可诱导血小板endostatin。桃红四物汤在2.5 mg/mL可显著抑制PAR1-AP诱导的VEGF和PAR4-AP诱导的endostatin分泌，尽管桃红四物汤可以抑制VEGF分泌，但血小板分泌VEGF仍显著高于对照组(0.1%DMSO)。见图1。

图1 桃红四物汤对PAR1激动剂，PAR4激动剂和凝血酶诱导血小板释放VEGF和Endostatin的影响(±s，n=3)Fig.1 Effect of Taohong Siwu Decoction on VEGF and endostatin releasing by PAR1-AP，PAR4-AP or thrombin activated platelets±s，n=3)

2.3 PAR1-AP，PAR4-AP和凝血酶诱导的血小板释放液对HUVECs增殖的影响及桃红四物汤的作用富血小板血浆经凝血酶(1 U/mL)，PAR1-AP作用后的释放液可显著诱导HUVECs增殖，但是经PAR4-AP作用后的释放液抑制HUVECs增殖;富血小板血浆经桃红四物汤(2.5 mg/mL)预处理后，可显著抑制PAR1-AP组的细胞增殖以及促进PAR4-AP组的细胞增殖;但是对凝血酶组没有显著作用，见图2。

图2 PAR1激动剂，PAR4激动剂和凝血酶诱导的血小板释放液对用HUVECs增殖的影响及桃红四物汤的作用±s，n=6)Fig.2 Influence of Taohong Siwu Decoction on HUVECs proliferation affected by secretions of activated platelets by PAR1-AP，PAR4-AP or thrombin HUVECs proliferation±s，n=6)

3 讨论

桃红四物汤是治疗血瘀证的经典名方，对于妇女月经不调，心脑血管疾病都有广泛的治疗作用［7］。中医理论对活血化瘀证治疗的根本理念之一是在活血祛瘀基础上，祛瘀生新、活血生脉，其重要的一个方面是对内皮细胞的调节作用。血小板的黏附性、聚集性增强，功能亢进是反映血瘀证的客观性指标之一。血小板活化参与了血瘀证的发生与发展，是血瘀证产生的重要病理生理基础。血小板除了参与血瘀的形成过程，它同样具有调节血管形成的作用，血小板来源的VEGF和bFGF在血小板促进内皮细胞增殖中起重要作用，其关键的过程是通过血小板膜受体途径释放促血管生成因子(VEGF、EGF、bEGF、PDGF等)和血管生成抑制因子(endostatin、PF-4、thrombospondin-1、α-macroglobulin、plasminogen active inhibitor-1等)。这些血管生成促进因子与抑制因子分别储存在不同的α颗粒中，当用PAR1-AP激活血小板时，释放促血管生成因子，而用PAR4-AP激活血小板，释放血管生成抑制因子［3］。凝血酶是PAR1和PAR4的激动剂，在激活血小板聚集的同时释放血管生成促进因子和抑制因子。由血小板释放的血管生成相关因子调节内皮细胞的增殖、迁移和分化，对活血化瘀作用具有重要的调节作用。

PAR1和PAR4是凝血酶作用于人血小板的受体，尽管PAR1和PAR4都属于G蛋白偶联受体家族成员，但是对凝血酶的亲和力以及诱导血小板的活化的途径不同［8-11］，其不同的激活状态可能是导致血瘀证的重要因素之一。本实验在体外考察了桃红四物汤对凝血酶及PAR1-AP和PAR4-AP诱导血小板聚集的作用，桃红四物汤可显著抑制凝血酶和PAR1-AP诱导的血小板聚集，而对PAR4-AP诱导的血小板聚集没有显著的抑制作用。由于凝血酶是血小板最强的激动剂，所以针对其受体的抑制剂是治疗心脑血管疾病重要途径。凝血酶激活PAR1可通过Gα12/13，Gα，和Gαi/z及细胞内信号途径导致血小板发生一系列功能改变，如TXA2合成，ADP释放，整合蛋白的表达及血小板聚集。PAR1激活也使得血小板处于超敏状态，如血栓和纤维蛋白生成增加。PAR4主要通过激活Gαq和Gα12/13途径激活血小板，和PAR1不同的是，PAR4不激活Gαi途径［12］。尽管蛋白酶激活受体途径及功能还没有完全阐明，但是PAR1选择性抑制剂相当于凝血酶抑制剂具有更强的优势，因为选择性抑制PAR1激活的血小板导致出血的风险大大降低［13］。

由于血小板释放血管生成相关因子对内皮细胞的调节作用，所以研究桃红四物汤对血小板不同状态下血管生成相关因子的表达非常必要。富血小板血浆经凝血酶和PAR激动剂诱导后释放VEGF和endostatin的量存在显著差异，凝血酶在1 U/mL浓度时对人血小板释放VEGF和endostatin没有显著变化，但是PAR1-AP(10 μmol/L)可显著增加VEGF释放，而PAR4-AP(200 μmol/L)可显著增加endostatin的释放，这与前期报道结果一致［14］;当血小板与桃红四物汤(2.5 mg/mL)预处理后，可显著抑制PAR1-AP诱导的VEGF释放以及PAR4-AP诱导的endostatin的释放，尽管抑制VEGF释放，当其含量仍高于未激活的血小板。进一步采用HUVECs增殖实验，发现凝血酶和PAR1-AP作用后的血小板释放液能刺激HUVECs增殖，PAR4-AP作用后的血小板释放液抑制HUVECs增殖。血小板与桃红四物汤(2.5 mg/mL)预处理后，可显著抑制PAR1-AP组的细胞增殖，同样也可以部分解除PAR4-AP组对HUVECs增殖的抑制作用，但是对凝血酶组引起的细胞增殖没有显著抑制作用。这可能是由于凝血酶同时激活释放多种内皮细胞生长调节因子造成。

本实验在体外考察了桃红四物汤对蛋白酶激活受体激活引起血小板聚集以及VEGF和endostatin释放的影响，结果表明，桃红四物汤可选择性抑制PAR1-AP引起的血小板聚集，说明桃红四物汤对凝血酶诱导的血小板聚集的抑制作用主要通过受体PAR1介导的信号途径。而血小板不同活化状态对VEGF和endostatin释放以及内皮细胞增殖的实验结果表明，桃红四物汤既可以抑制PAR1-AP活化血小板诱导内皮细胞增殖，同时又可以减少PAR4-AP活化血小板对内皮细胞增殖的抑制作用，表现出稳定血小板的作用，这和血小板释放液中VEGF和endostatin有相关性。桃红四物汤对蛋白酶激活受体激活引起血小板聚集及VEGF和endostatin释放的作用，可能是桃红四物汤发挥活血化瘀作用的机制之一。

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