大孔树脂分离纯化羟基酪醇工艺研究

党建章，金元宝，毛友枚，代建国，金刚

(深圳职业技术学院应用生物技术系，广东深圳518055)

欧橄榄(Olea europaea L.)也称油橄榄是地中海国家著名的亚热带果树和重要经济林木，含丰富优质食用植物油—橄榄油，同时含有丰富多样的酚类化合物［1-3］。大量研究表明:该酚类化合物具有抗菌、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化、抑制DNA氧化损伤、保护皮肤光损伤以及抗炎等活性［4-6］。研究还表明:橄榄叶中含有的抗氧化活性的酚类化合物的量明显高于橄榄果、树皮和橄榄油。近年来全国欧橄榄种植面积逐年增加，预计今后10年我国欧橄榄产业将进入蓬勃发展期［7］，届时将有大量廉价的橄榄叶供应，为橄榄叶提取物产业的发展提供了广阔的空间，具有良好的发展前景。

羟基酪醇(Hydroxytyrosol)化学名为3，4-二羟基苯乙醇，属两性分子，既脂溶也水溶。羟基酪醇有很强的抗氧化作用，能阻止多不饱和脂肪酸的自氧化，羟基酪醇对自由基的清除能力比其他抗氧化物质都高，可有效地清除内源性和外源性的自由基和氧化物，包括过氧化氢、超氧化物阴离子以及次氯酸等，是一种值得研究和大力开发的天然食品抗氧化剂。自然界中天然的羟基酪醇很少以游离的形式存在，由于橄榄叶中含有0.5%～2.0%的橄榄苦苷(oleuropein)，因此国外实验室多用硫酸或盐酸来酸解橄榄苦苷生产羟基酪醇［8］，酸解过程见图1。

图1 橄榄苦苷酸解生成羟基酪醇

目前从橄榄叶中分离纯化羟基酪醇，国内还刚起步，本实验在现有的工作基础上［9-10］，筛选适用的大孔吸附树脂进一步分离纯化羟基酪醇，为羟基酪醇的产业化生产奠定基础。

1 仪器、材料和试剂

LC-20A岛津高效液相色谱仪:包括二元泵、DAD检测器、柱温箱、真空脱气机、自动进样器;LR4000旋转蒸发仪(Heidolph);SHZ-D(Ⅲ)循环式真空泵;美国PALL cascada IX型超纯水制备仪;KQ3200DE型数控超声波清洗器;日本TOMY KOGYO CO，LD自动高压灭菌锅。

羟基酪醇对照品购自成都普瑞法科技开发有限公司，批号为080928，纯度≥98%;橄榄叶由深圳市力可生物技术有限公司提供(西班牙进口)，橄榄苦苷质量分数为1.7%，羟基酪醇质量分数为0.05%;Ⅱ型ZTC1+1天然澄清剂购自天津正天成澄清技术有限公司;大孔吸附树脂AMBERLITE-XAD4(简称XAD4)由深圳市力可生物技术有限公司提供，HP20、LX-18C、HPD400A购自天津市光复精细化工研究所;色谱纯三氟乙酸、甲醇、乙腈购自天津协和昊鹏色谱科技有限公司;水为重蒸蒸馏水;其余试剂均为国产分析纯。

2 羟基酪醇定量测定［9］

2.1 色谱条件流动相:A为三氟乙酸水溶液(pH 2.5)，B为乙腈，体积流量:1 mL/min，检测波长:280 nm，柱温:30℃，检测时间:30 min，进样量:5 μL，羟基酪醇保留时间约为10.5 min左右，梯度洗脱程序为:流动相B:0 min 5%;30 min 25%。

2.2 对照品贮备液的制备精密称取羟基酪醇对照品10.0 mg，置100 mL量瓶中，用体积分数60%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配成0.1 mg/mL的贮备液备用。

2.3 对照品标准曲线的确定用LC-20A岛津高效液相色谱仪检测，对照品的进样量为1、5、10、20、40 μL，以对照品进样量为横坐标，以峰面积为纵坐标计算回归方程，结果表明羟基酪醇在0.1 μg～4μg范围内呈良好的线性关系。回归方程为:Y=748 755X-7 166.6(r=0.999 2)。

2.4 样品羟基酪醇纯度的测定精密称取经过真空旋转蒸发，干燥至恒质量的样品，用60%甲醇定容，HPLC检测，根据回归方程计算得到橄榄苦苷含有量，按下式计算橄榄苦苷纯度。橄榄苦苷纯度=固形物中橄榄苦苷质量/固形物质量×100%。

3 方法与结果

3.1 羟基酪醇的粗提取称取干燥并粉碎的橄榄叶，按照料液比1∶30加入0.5 mol/L HCl，在温度105℃、压力20.79 kPa(高压灭菌锅表压)条件下水解15 min，趁热过滤，滤液冷却至室温后，用5 mol/L NaOH调节至pH 5，加入经预处理的ZTC1+1天然澄清剂，ZTC1+1添加量为:B组分的最终质量浓度为0.2 g/L;A组分的最终质量浓度为0.1 g/L，添加顺序为先加B组分后再加A组分，加完每一种组分后都放置在100℃的水浴锅中水浴2 h，水浴完成后，冷却至室温，真空抽滤，除去滤渣，按上述条件澄清3次后备用，称为粗提液，粗提液羟基酪醇质量浓度为0.62 mg/mL。

3.2 大孔树脂预处理大孔树脂用95%乙醇浸泡过夜，清洗后，再换用95%乙醇浸泡120min，然后用蒸馏水洗至无醇味后备用。

3.3 大孔树脂筛选分别称取预处理的HP20、LX-18C、AMBERLITE-XAD4(简称XAD4)、HPD400A树脂各10 g，装具塞瓶中，每种树脂称取两份，每份树脂中加粗提液50 mL(经前期试验确定的加量)，30℃，120 r/min振荡吸附过夜，真空抽滤，抽滤后每份树脂中加蒸馏水50 mL，30℃振荡洗涤5 min，然后抽滤，分别检测吸附液和水洗液。在吸附后的树脂中各加入40%乙醇50 mL，30℃振荡120 min解析，然后真空抽滤，解析液取样检测，重复上述解析过程，共解析3次，平均结果见表1。

表1 4种树脂吸附和解析率的实验结果

从上述结果可知:XAD4树脂和LX-18C树脂的吸附率、水洗率、解析率都较理想，从树脂来源和成本综合考虑我们选择XAD4树脂继续以下实验。

3.4 XAD4树脂的吸附时间称取预处理的XAD4树脂100 g，加粗提液500 mL，每隔30 min，取样检测羟基酪醇的峰面积，计算吸附率。结果见表2(表中的实验数据为平行实验2次的平均结果)。

表2 XAD4树脂吸附时间的选择

从上述结果可知:XAD4树脂吸附120 min后，吸附率可达90.2%，因此吸附时间以120 min为宜。

3.5 乙醇解析浓度的确定取上述吸附羟基酪醇的树脂100 g，加蒸馏水500 mL洗涤，真空抽滤，洗水取样检测，峰面积为55 985，羟基酪醇损失率为2.4%;称取上述抽滤后的树脂10 g，共3份，每份中分别加入20%、40%、60%的乙醇50 mL，37℃振荡解析，解析120 min后取样检测，按上述条件再重复解析一次，结果见表3(表中的实验数据为平行实验2次的平均结果)。

从上述结果可知:选用60%乙醇解析，两次解析率之和为89.3%。

3.6 XAD4树脂的放大实验称100 g经处理的XAD4树脂，加入500 mL上述澄清液，吸附饱和、洗涤后加入60%乙醇500 mL，37℃振荡解析120 min，抽滤收集解析液，按以上条件再解析一次，将两次解析液合并，取样待检，然后将合并的解析液浓缩至45 mL，取样待检。用乙酸乙酯进行萃取，经3次萃取后合并萃取液，总体积为300 mL，将萃取液置旋转蒸发仪中蒸干，干燥器干燥24 h称质量(蒸发干燥后的瓶质量减去蒸发前的瓶质量)，得到羟基酪醇的干质量为438.7 mg，蒸馏瓶用60%甲醇溶解并洗涤，溶解样定容到30 mL，取样待检，结果见表4。

表3 不同含乙醇量解析的解析结果

表4 XAD4树脂的放大实验结果

从上述结果可知:采用XAD4树脂分离纯化羟基酪醇其吸附率为91.1%，解析率为91.6%，纯度可达44.1%。

4 讨论

4.1 本实验采用树脂静态吸附和静态解析，简化了工艺，工业上只需带搅拌的搪瓷罐进行吸附和解析，省去了树脂柱，降低了成本，具有实用价值。

4.2 羟基酪醇为油状物，浓缩后不能用常规的喷雾干燥器干燥，在浓缩物中加入适当的填充剂，使产品成粉末状，还有待进一步研究。

［1］柏方敏.油橄榄产业考察报告［J］.湖南林业科技，2008，35(1):36-38.

［2］Keys A.Mediterranean diet and public health:personal reflections［J］.Am J Clin Nutr，1995，61(6):1321–1323.

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［4］Vissers MN，Zock PL，Katan MB.Bioavailability and antioxidant effects of olive oil phenols in humans:a review［J］.Eur J Clin Nutr，2004，58:955-965.

［5］张小梅.羟基酪醇生物学作用的细胞与分子机制研究［D］.大连:大连医科大学，2008.

［6］Schaffer S，Podstawa M，Visioli F，et al.Hydroxytyrosol-rich olive mill wastewater extract protects brain cells in vitro and ex vivo［J］.J Agric Food Chem，2007，55(13):5043-5049.

［7］张东升，黄易，夏自谦.论我国油橄榄产业发展规划［J］.林产工业，2010，37(2):50-55.

［8］De Leonardis A，Aretini A，Alfano G，et al.Isolation of a hydroxytyrosol-rich extract from olive leaves(Olea Europaea L.)and evaluation of its antioxidant properties and bioactivity［J］.Eur Food Res Technol，2008，226(14):653-659.

［9］党建章，侯金星，黄志斌，等.盐酸水解橄榄苦苷粗提物制备羟基酪醇［J］.中药材，2011，34(6):983-985.

［10］金元宝，党建章，代建国，等.羟基酪醇分离纯化方法研究进展［J］.食品科技，2011，36(7):174-177.