葫芦素B抗肿瘤作用及其机制研究进展

张延亭，欧阳东云，何贤辉

(暨南大学生命科学技术学院组织移植与免疫实验中心，广东 广州 510632)

葫芦素B(cucurbitacin B)是从葫芦科等植物中分离得到的一类四环三萜类化合物，是葫芦素家族中含量最丰富的成员，具有广泛的药理活性。现代研究表明，葫芦素B具有保护肝、消炎和抗肿瘤等多种生物学活性［1-3］。20世纪70～80年代，国内已研发出葫芦素片(含葫芦素B和葫芦素E)用于肝炎和原发性肝癌的辅助治疗［4］。近年来，国内外学者对葫芦素B的抗肿瘤作用进行了较为系统的研究，发现葫芦素B具有较强的抑制STAT3转录因子活化的作用，并认为其抗肿瘤活性与抑制STAT3转录因子的活化有关［3，5-9］。然而，也有不少研究报道，葫芦素B的药理活性与抑制STAT3转录因子的活化无关［10-12］。目前较多研究表明，葫芦素B可导致肌动蛋白细胞骨架的快速破坏，这种作用与其抗肿瘤作用密切相关［12，14-17］。由此可见，葫芦素 B抗肿瘤作用机制还存在争议，待深入研究。

1 葫芦素B的抗肿瘤作用

1.1 葫芦素B的体外抗肿瘤作用

葫芦素B对多种白血病和淋巴瘤细胞具有明显抑制作用。葫芦素 B对5种白血病细胞 CCRF-CEM，K562，MOLT-4，RPMI-8226和 SR 的 IC50值为 15.6 ～35.3 nmol·L-1，并可引起G2/M期阻滞和凋亡［17］。此外，葫芦素B对人淋巴瘤U937细胞的 IC50值为9.2 nmol·L-1，与抗癌药物喜树碱相近［18］。Haritunians等［19］报道，葫芦素B对多种白血病和淋巴瘤细胞生长具有抑制作用。这些研究表明，体外培养的血液系统肿瘤细胞对于葫芦素B的作用具有较高的敏感性。

葫芦素B对源自实体瘤的贴壁肿瘤细胞也表现出广泛的抗肿瘤活性，其敏感性与白血病细胞相似。葫芦素B对多种人乳腺癌细胞［16，20］、多形性胶质母细胞瘤细胞［14］、结肠癌SW480 细胞［12］、喉鳞状细胞癌 Hep-2 细胞［3］、肝癌 BEL-7402和HepG2细胞［7，21］、胰腺癌细胞［8-9］和皮肤鳞癌细胞［22］等体外增殖具有浓度依赖性抑制作用，其IC50值为10-8～10-7mol·L-1，敏感性与血液系统肿瘤相似。此外，一些含葫芦素 B 的植物提取物也具有广泛的抗肿瘤作用［2，13，23］。值得注意的是，在葫芦素B的作用下，这些肿瘤细胞往往快速发生细胞形态的变化，导致细胞周期阻滞于G2/M期，并可诱发多核细胞的形成和肿瘤细胞凋亡。上述研究结果提示，葫芦素B作为一种潜在的细胞骨架靶向药物，可通过破坏细胞骨架尤其是微丝的结构，导致细胞变形等现象的发生。

1.2 葫芦素B的体内抗肿瘤作用

Wakimoto等［16］用乳腺癌动物模型研究发现，ip给予葫芦素B 6周后，肿瘤体积较对照组缩小55%，器官和组织并未见明显损伤。Thoennissen等［9］研究表明，葫芦素B可明显抑制胰腺癌生长(用药组肿瘤体积较对照组减少69.2%)及限制肿瘤转移，且小鼠未呈现体质量减轻等不良反应。Liu等［24］报道，葫芦素B可显著抑制喉鳞癌裸鼠移植瘤的生长。Chan等［21］研究表明，葫芦素B亦可抑制人肝癌BEL-7402移植瘤的生长。Sun等［6］报道，葫芦素B对人肺腺癌A549裸鼠移植瘤的抑制率为53.6%。上述研究表明，可耐受剂量的葫芦素B具有抗肿瘤作用，提示该药物具有潜在的抗肿瘤临床应用价值。

2 葫芦素B的抗肿瘤作用机制

2.1 葫芦素B对细胞信号转导通路的影响

肿瘤是一类细胞信号转导失调的疾病，这也使得基于信号转导的肿瘤靶向治疗成为肿瘤研究领域的重要方向。目前，葫芦素B抗肿瘤的相关研究多集中在STAT3转录因子和丝裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号转导通路。

2.1.1 STAT3 信号转导通路

研究发现，多种恶性肿瘤存在STAT3通路的活化，抑制STAT3通路可能会抑制肿瘤生长和引起肿瘤细胞凋亡，因此筛选STAT3的抑制剂正日益受到重视［25］。研究表明，葫芦素B及其他葫芦素家族成员可抑制肿瘤STAT3通路的活化［3，5-9］，如对多种肿瘤细胞，葫芦素Ⅰ(JSI-124)10 μmol·L-1作用4 h后，均可在不影响STAT3蛋白水平情况下显著降低STAT3的磷酸化［26］，提示抑制STAT3活化可能是葫芦素抗肿瘤作用的重要机制。然而，最近一些研究并不支持这一观点。有学者报道，高浓度葫芦素B(50 μmol·L-1)可抑制K562细胞STAT3的磷酸化，而较低浓度葫芦素B(5 μmol·L-1)对STAT3的磷酸化水平并无影响，但仍可抑制细胞生长［17］。葫芦素E的作用也表现出类似的现象［18］。此外，目前公认的STAT3抑制剂葫芦素Ⅰ对STAT3基因敲除的成纤维细胞和正常细胞生长的抑制作用相似，提示葫芦素Ⅰ对细胞生长的抑制作用可能与抑制STAT3的活化无关［10］。据报道，葫芦素B也不影响人肝癌 BEL-7402细胞 STAT3的磷酸化水平［21］。Tannin-Spitz等［13］发现，葫芦素B/E糖苷可引起乳腺癌细胞STAT3的活化。值得关注的是，葫芦素B对STAT3信号通路的影响晚于细胞形态和其他一些信号通路的变化［17］。可见，葫芦素B对STAT3活化的影响因细胞和药物浓度而异，其抗肿瘤活性可能涉及其他更为上游的作用靶点。

2.1.2 MAPK 信号转导通路

MAPK信号转导通路控制细胞增殖、分化和凋亡等多种生理过程，在细胞信号网络中起重要作用。已往研究表明，葫芦素B对该信号转导通路的影响因细胞而异。如葫芦素B对脑瘤细胞细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)1/2磷酸化有抑制作用［14］，并在短时间内明显抑制K562细胞中c-Raf、丝裂原活化蛋白和ERK1/2的磷酸化，其影响早于对STAT3的抑制［17］。然而，在人肝癌BEL-7402细胞中，葫芦素B抑制c-Raf活化而促进ERK1/2的磷酸化，这种矛盾现象可能归因于信号通路间的交联［21］。此外，在人肺腺癌A549和喉鳞癌细胞中，葫芦素B可引起ERK1/2的活化［3，6］。同样，葫芦素 B对 JNK的影响也有类似现象。在人肺腺癌A549细胞中，葫芦素B用药4 h后，可抑制JNK1的磷酸化，而在脑瘤细胞中葫芦素B却可诱导JNK，c-JUN和P38 MAPK的磷酸化，并且在抑制JNK活化后可减弱细胞形态的变化程度［14］，提示JNK/c-Jun信号转导通路在葫芦素B的抗脑瘤作用中可能发挥一定作用。因此，葫芦素B对MAPK信号转导通路的影响比较复杂，而且因细胞而异，其作用机制仍需进一步研究。

2.1.3 其他信号通路

葫芦素B对磷酸肌醇-3激酶/磷酸酶及张力蛋白同源的基因蛋白/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)和NF-κB信号转导通路的影响也有报道。葫芦素B/E糖苷引起乳腺癌细胞PKB降低［13］，而在人肺腺癌A549细胞中葫芦素B不影响PKB活化［6］。研究表明，ERK和mTOR可磷酸化S6激酶从而诱导缺氧诱导因子1α表达［27］;而在人肝癌Hep3B细胞，葫芦素B可抑制缺氧诱导因子1α表达，其对NF-κB的抑制作用甚至超过已知 NF-κB抑制剂雷公藤红素［29］。这些研究表明，葫芦素B可能影响相当广泛的细胞转导通路。

2.2 葫芦素B对细胞骨架的影响

葫芦素可引起细胞形态的急剧改变［11，13-16，20］，提示影响细胞骨架是葫芦素类药物的共性。葫芦素B可引起脑瘤细胞骨架发生快速而显著的变化，并且对微丝的影响早于微管［13-14］。同样，在乳腺癌细胞中，葫芦素B可快速诱发微丝结构改变，随后微管也受到影响［16］。此外，Haritunians等［19］研究表明，葫芦素B可引起白血病细胞纤维状肌动蛋白聚集，而微管基本未受影响。这些研究说明，葫芦素B可先引起微丝结构的改变，随后诱发微管结构的变化，提示肌动蛋白细胞骨架可能是其潜在的作用靶标。

微丝主要以球状肌动蛋白和纤维状肌动蛋白动态平衡形式存在。有研究表明，葫芦素可引起纤维状肌动蛋白的解聚，并导致肌动蛋白聚集［10-11，14-15，18-19，29-30］。Momma 等［31］研究报道，葫芦素E可直接作用于微丝。Nakashima等［18］用生物素标记的葫芦素E进行亲和层析，发现葫芦素E和葫芦素Ⅰ均可浓度依赖性地抑制丝切蛋白的磷酸化。Escandell等［11］报道，葫芦素B衍生物可诱导凝溶胶蛋白表达，其作用不依赖于P53。但是最近研究表明，葫芦素Ⅰ与丝切蛋白和凝溶胶蛋白的化学修饰无关［30］。这些研究表明，葫芦素类药物可能是通过影响肌动蛋白细胞骨架的调控因子，破坏了肌动蛋白的动力学平衡，从而诱发肌动蛋白的异常聚集。

肌动蛋白聚合/去聚合状态的改变与诸多细胞生理过程如胞质分裂、凋亡、运动和分泌等有关，一旦药物影响到这种平衡，对细胞的影响是广泛而深远的。葫芦素B引起的细胞形态和功能的改变，如信号转导紊乱、细胞周期阻滞、细胞多核化、细胞运动丧失和细胞凋亡等，可能与微丝骨架的受损有关。有研究表明，肌动蛋白细胞骨架的破坏可抑制PKB的磷酸化，从而抑制存活素的表达［32］。葫芦素B/E糖苷也可引起类似的改变［13］。葫芦素B停药后，细胞变形改善，增殖能力也明显增强［10，14］。此外，据报道，葫芦素作用后，细胞的运动能力几乎完全丧失［30］。与葫芦素相似，其他抗肌动蛋白的药物如加斯诺利(jasplakinolide)和抗微管蛋白的药物如长春新碱也能限制肿瘤细胞的运动［33］。综上所述，葫芦素B可能通过破坏肌动蛋白细胞骨架而发挥其抗肿瘤作用。

2.3 葫芦素B对细胞周期的影响

周期蛋白和细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin dependent kinase，CDK)组成的蛋白激酶复合体推动细胞周期进程，如果遇到不利于细胞周期的刺激，细胞会利用各阶段的细胞周期调控机制做出相应调整。抑制G1期的蛋白激酶复合体在G1/S期调控中发挥重要功能，如P21Waf1/Cip1可通过引起周期蛋白E-CDK2蛋白激酶复合体的失活，导致G1/S期阻滞;P21也可引起G2/M期阻滞［34］;而葫芦素B可诱导肿瘤细胞P21 的表达［8，9，13］。P34CDC2蛋白激酶(CDK1)是真核细胞G2/M期的关键调控蛋白［32］。葫芦素 B/E糖苷用药1 h后P34CDC2表达下调，24 h后P34CDC2与周期蛋白B1的表达显著减少［13］。此外，葫芦素B能下调周期蛋白A，周期蛋白B1，周期蛋白 D1，P34CDC2和 CDC-2 的表达［3，9，21-22］。由此提示，葫芦素B及其衍生物可能影响多种细胞周期调控蛋白的表达和功能。

需要注意的是，葫芦素B停药后，细胞形态逐步改善，增殖能力显著增强，但是多数细胞变为大型多核细胞［9，14］，提示葫芦素B对胞质分裂的影响较大，而对核分裂影响较小，而且对胞质分裂的影响不易修复。如果上述推论正确，那么多数研究中检测到的G2/M期阻滞细胞，很可能是已进行完核分裂而胞质分裂无法继续的四倍体细胞。鉴于已知影响微丝骨架的药物都会导致不同程度的细胞周期阻滞，葫芦素B引起的细胞周期阻滞很可能是微丝骨架受损的后果。

2.4 葫芦素B诱导肿瘤细胞凋亡的机制

葫芦素B诱导肿瘤细胞凋亡与Bcl-2家族、存活素、胱天蛋白酶家族、线粒体膜电位、P53和P21等因素有关。在多种肿瘤细胞中，葫芦素B及其衍生物可抑制Bcl-2和存活素的表达［3，5，8-9，13］，激活胱天蛋白酶［8-9，12-13］以及导致线粒体的膜电位或通透性发生变化［3，5，13，35］。同时，葫芦素 B 还可使 P21或 P53表达上调［8-9，13］。一方面，P53 可特异性地抑制Bcl-2的表达，促进Bax的表达，似乎有利于细胞凋亡;另一方面，P53诱导P21上调可提高细胞的存活率［36］。有研究显示，P53和P21有利于结肠癌HCT116细胞拮抗葫芦素所诱导的细胞凋亡［11］，提示葫芦素B所引起的P21表达上调可能与肿瘤细胞的抗凋亡作用有关。虽然多数研究显示葫芦素 B 可诱导肿瘤细胞凋亡［5，8-9，12-13，35］，但仍有一部分研究表明该药对细胞凋亡无明显影响［3，6，14，19］，甚至具有抗凋亡作用［37-39］。可见，其诱导肿瘤细胞凋亡的机制待深入研究。

2.5 葫芦素B对活性氧的影响

很多肿瘤细胞中活性氧(reactive oxygen species，ROS)含量较高，有利于肿瘤的增殖和转移，并且与肿瘤的耐药性有关。有研究表明葫芦素类药物具有抗氧化作用［2，40］，但Yasuda等［12］发现葫芦素B引起SW480细胞内ROS升高，并以ROS依赖的方式诱导细胞凋亡。这些研究表明，葫芦素B对ROS的影响可能因细胞而异，还需深入研究。

3 展望

葫芦素B作为葫芦素家族的重要成员，其抗肿瘤作用日益受到重视。虽然其抗肿瘤活性可能与抑制STAT3活化有关，但越来越多的研究表明，葫芦素B的抗肿瘤作用与其破坏肌动蛋白细胞骨架的活性关系密切。因此，深入研究其干扰肌动蛋白细胞骨架的作用，将为葫芦素B以肌动蛋白骨架为靶点的抗肿瘤治疗奠定实验基础。

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