肺炎链球菌流行病学研究进展

张天栋， 张 泓

肺炎链球菌流行病学研究进展

张天栋， 张 泓

肺炎链球菌； 耐药性； 疫苗； 多位点序列分型

肺炎链球菌（SP）是临床常见的主要病原菌之一，可以引起肺炎、中耳炎、鼻窦炎、脑膜炎和败血症等疾病。据WHO估计［1］，每年大约有160万人死于SP感染，其中5岁以下儿童占43.8%～62.5%，且大多数分布在发展中国家，SP性疾病（PD）成为5岁以下、疫苗可预防性疾病的首位致死因素。近些年来，SP的耐药问题日趋严重，多重耐药SP（MRSP）在世界范围内播散，给临床治疗带来新的挑战。本文就SP的耐药变化趋势、主要耐药及耐药传播机制、血清群／型分布和分子流行病学特征进行综述。

一、耐药趋势

长期以来，抗生素在治疗SP感染方面发挥着主导作用，但是近些年来常用抗生素，特别是β内酰胺类和大环内酯类抗生素的耐药问题已演变成全球性的问题。自1967年首次在澳大利亚发现青霉素耐药SP（PRSP）以来，世界各地不断检获PRSP以及青霉素中介SP（PISP），PISP和PRSP统称为青霉素不敏感SP（PNSSP）。据SENTRY 报道［2］，美国PNSSP（MIC＞2 mg／L）的检出率2007年为11.4%，2008 年 上 升 至 13.5%，2009 升 高 至15.9%。欧洲国家PNSSP的检出率，据EARSS［3］报道，德国、法国、英国和西班牙2008年分别为5%、30%、5%和23%，2010年分别为4%、28%、3%和30%。日本PNSSP的检出率，2006年为4.0%，2007年为5.1%［4］。亚洲其他国家和地区PNSSP的检出率，据 ANSORP报道［5］，2008—2009年韩国2.2%、越南0.9%、中国台湾0.4%、中国香港1.5%。中国CHINET细菌耐药性监测网报道［6-7］，我国大陆地区 PNSSP的检出率，2009年为26.4%，2010年为23.4%。2008年CLSI修改了青霉素的折点判定标准，上述文献报道的青霉素的不敏感率均采用新标准。虽然新标准下SP对青霉素的不敏感率处于较低水平，但我国PNSSP的检出率显著高于其他亚洲国家和地区，应引起广大医务工作者的足够重视。

SP对大环内酯类抗生素的耐药形势十分严峻，红霉素不敏感肺炎链球菌（ENSSP，MIC＞0.25 mg／L）的检出率持续处于高位。据SENTRY项目报道［2］，2007年美国ENSSP的检出率已高达32.6%，2009年则上升到39.2%。亚洲国家和地区SP对大环内酯类抗生素的耐药状况更为严峻，ANSORP对亚洲11个国2008—2009年临床分离SP的回顾性研究显示［5］，亚洲主要国家和地区ENSSP的检出率日本66.7%、韩国81.7%、泰国51.4%、越南82.9%、我国香港75.5%、我国台湾87.1%。我国大陆地区ENSSP的检出率近些年来持续升高，据ANSORP［5］报道，2001年大陆地区ENSSP的检出率为73.9%，到2009已攀升至96.4%，且检出的ENSSP大都为极高水平耐药菌株（MIC＞256 mg／L）。

二、主要耐药机制及耐药传播机制

（一）β内酰胺类抗生素耐药机制 SP对青霉素等β内酰胺类抗生素的耐药性主要是通过青霉素结合蛋白（PBPs）的改变产生的，变构的PBPs减少了其对抗生素分子的亲和性，从而导致了细菌耐药的发生。现已发现在SP中有5个PBPs高分子量蛋白（PBPsla、lb、2x、2a、2b）和1个低分子量蛋白，多数SP青霉素耐药是由PBP2x、PBP2b和PBPla这3个PBPs的改变引起的，PBP2x和PBP2b的改变与细菌的低水平青霉素耐药有关，同时也是PBP-la改变介导的高水平青霉素耐药的基础。另外，非PBPs改变导致SP耐药的机制近些年来也逐渐被人们认识，主要包括：①Cia H变异：Cia H基因编码跨膜组氨酸激酶，该酶胞外N端有感应器功能，可感受周围环境中的Ca2＋浓度变化，胞内C端有激酶活性，可激活胞质内转录调节蛋白CiaR，CiaR可调控多个目的基因的转录，这些目的基因可参与磷壁酸的修饰、糖类代谢调控和蛋白激酶的成熟等，从而对细菌细胞壁合成产生调控作用。Cia H基因缺失或突变会使SP信号转导中断，进而使CiaR不能发挥正常的转录调控作用，导致其对青霉素和头孢噻肟耐药，并对各种早、晚期细胞壁抑制剂（如环丝氨酸、杆菌肽、万古霉素等）所致的细胞溶解产生很高的抵抗性［8-10］。②mur M：mur M基因编码氨基酰连接酶，催化 Ala-t RNAAla或Ser-t RNASer连接到SP脂质代谢中间产物Ⅱ（肽聚糖合成中间产物）上，这些丙氨酸之间、丙氨酸与丝氨酸交叉连接，使SP细胞壁出现肽聚糖敷层，导致高水平青霉素耐药及头孢噻肟、头孢曲松耐药。但mur M基因单独并不能引起SP耐药，必须是在PBP2x、2b、1a基因变异的基础上发挥作用［11-12］。

（二）大环内酯类抗生素耐药机制 SP对大环内酯类抗生素的耐药机制主要包括：①核糖体靶位点的改变：主要由ermB基因介导，ermB基因编码核糖体甲基化酶，可以使SP核糖体50S亚基23Sr RNA 2058位的腺嘌呤残基二甲基化，该位点是大环内酯类抗生素结合到细菌核糖体的关键位点，2058位腺嘌呤残基二甲基化降低了大环内酯类抗生素与核糖体的亲和力。该机制引起大环内酯类抗生素高水平耐药（红霉素MIC＞64 mg／L），且与林可酰胺类抗生素和链阳菌素B交叉耐药，耐药表型为MLSB。ermB在SP中由可结合转座子Tn1545或Tn3872携带，因erm B上游调控序列的不同，MLSB又可分为c MLSB（结构型）和i MLSB（诱导型），后者主要对14元环、15元环大环内酯类抗生素耐药，对林可酰胺类抗生素及链阳菌素敏感，对16元环大环内酯类抗生素部分敏感。②主动外排机制增强：由mef基因编码的主动外排泵介导，促进药物外排对14、15元环大环内酯类抗生素低水平耐药（红霉素MIC 1～32 mg／L），而对16元环大环内酯类抗生素、克林霉素和链阳菌素B敏感。③核糖体突变：除以上两种主要耐药机制外，近年来研究证明核糖体突变也可导致大环内酯类抗生素耐药，迄今为止发现的核糖体突变包括23Sr RNA突变和（或）编码L4、L22蛋白基因突变。Reinert等［13］研究证实，与SP对大环内酯类抗生素耐药相关的23Sr RNA突变主要包括A138→G、A373→T、A260→G、T389→C、A449→C和A1745→T，突变的23Sr RNA降低了其与大环内酯类抗生素的亲和力，从而导致了SP耐药的发生。L4、L22蛋白突变导致大环内酯类抗生素耐药的机制学者有不同的认识。Depardieu等［14］认为是突变的L4、L22蛋白通过与23S r RNAⅠ区结合，扰乱了Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ区的构象，从而影响Ⅴ区转肽酶中心附近位点与抗生素的结合，降低了药物的抗菌活性。沈叙庄等［15］认为是L4蛋白修饰使多肽链通道变窄，致使大环内酯类抗生素结合部位远离该通道而失效。与L4蛋白突变相反，L22蛋白突变使得多肽链通道变宽，以无效的方式结合大环内类抗生素。需要指出的是，不同耐药机制在不同国家和地区的分布是不同的，SP对大环内酯类抗生素的耐药性在欧洲和亚洲主要是由ermB基因介导的，在北美主要是由mef基因介导的。我国检出的大环内酯类抗生素耐药表型以MLSB型居多，但erm B（＋）mef A／E（＋）表型SP在我国正呈逐年上升的趋势。

（三）耐药传播机制 SP的耐药性主要通过2条途径传播：①克隆传播。同一来源菌株在人群中传播，通过旅游、接触等途径造成流行。②水平传播。耐药基因经转化、转导或接合转座子接合转移给敏感菌，使后者产生耐药性，耐药基因可来自耐药性SP或其他种属细菌。国外研究发现，转座子在SP耐药进化中起重要作用，与质粒DNA无关的耐药性传递主要由转座因子完成。目前主要与耐药相关的转座子和转移方式有：①Tn916-1545接合转座子家族［16-17］。可携带大环内酯类抗生素耐药基因ermB、四环素类耐药基因tet M、和卡那霉素耐药基因aph A-3，并能在无质粒带动下在同种或不同种的细菌间进行接合转移。②Tn1207.1［18］和mega插入元件［19］。携带大环内酯类抗生素外排基因mef A或mef E及ABC外排系统，编码细菌对抗菌药物的外排作用，经转化和同源重组转移播散。③复合转座子Tn2009［20］。由带有大环内酯外排基因mef E的mega插入元件整合到1个带有四环素耐药基因tet M的Tn916类转座子上形成，其上还携带了与金葡菌转运蛋白msr D基因高度同源的序列，可能与mef E共同编码SP对药物的主动外排。Tn2009可经转化使敏感菌株获得耐药性。SP染色体上的转座子可捕获其他耐药元件形成多重耐药复合转座子，且携带耐药基因的转座子具有广泛的宿主范围，可经多种转移方式引起耐药基因在相同或不同种属细菌中水平传播，还可稳定地传给子代，随耐药菌株克隆播散。

三、血清群／型分布和SP疫苗应用

根据荚膜多糖免疫原性的不同，SP可分为93种血清型，但多数血清型很少引起疾病，世界范围内至少70%～75%的侵袭性PD（IPD）是由13种常见的血清型引起的。SP疫苗是预防其感染的重要手段。Pilishvili等［21］的调查显示PCV7应用后，IPD在美国整体人群的发病率下降了45%；Shea等［22］的调查显示，急性中耳炎在3岁以下美国儿童中的发病率下降了12%。与疾病相关的血清群／型可随时间、地点、年龄不同而变化。西班牙的一项调查显示［23］，PCV7覆盖的血清型（23F除外）从20世纪80年代早期开始增长，一直到本世纪初开始下降；非PCV7覆盖的1、5、7F则从20世纪80年代起开始下降，一直到20世纪90年代末期血清型1、5、6A、7F和19A开始迅速增长。国内Yao等［24］的调查显示，当前我国儿童感染SP的主要血清型为19F、19A、23F、6B和14，但19A在小于2岁婴幼儿中比在2～5岁儿童中常见，14型SP则相反。选择或研制疫苗前应首先了解本地区SP的血清群／型构成，疫苗应能覆盖主要血清型尤其是多重耐药菌株的血清型，才能达到良好的效果。

PCV7应用后，疫苗覆盖的血清型有了显著下降，非疫苗覆盖的血清型有了稳定提升，我们称之为“血清型替换”。PCV7应用后，在法国和我国香港PCV7覆盖的血清型分别下降了26.0%和23.8%，非PCV7覆盖的血清型分别上升了32.5%和28.7%；在美国和苏格兰由PCV7覆盖血清型引起的IPD分别下降了94%和15%，非PCV7覆盖血清型引起的IPD分别上升了3.4～7.1例／10万和2.1～3.5例／10万［21，25］。研究发现，SP疫苗还可以延缓细菌耐药性的产生和扩散。PCV7应用后，PNSSP和ENSSP的检出率美国社区获得性呼吸道感染患者分别下降了37.3%和34.8%，欧洲小于5岁儿童分别下降了39.6%和39.5%［25-28］。但 SP 疫苗对抗生素耐药率的影响可能因血清型而异，在使SP耐药率整体下降的同时，PCV7可能导致非疫苗覆盖血清型菌株的耐药率升高。Farrell等［27］的调查显示，PCV7应用后，非疫苗覆盖的PNSSP、ENSSP和MRSP在美国儿童中的检出率分别升高了45.1%、44.3%和28.5%。因此，SP疫苗对抗生素耐药率的影响还需要进行长期的综合评估。

四、多位点序列分型（MLST）

要区分SP耐药性的传播方式，了解耐药克隆的遗传背景，追踪耐药株的起源和进化路径，必须借助于分子生物学的方法。MLST是在多位点酶电泳的基础上发展起来的，通过对SP的管家基因直接测序和与基因库中已知序列的等位基因进行序列对比，分析菌株间的序列差异和关系，从而追踪耐药菌株间的亲缘关系及播散途径，实现了在互联网上比较和分析不同实验室间结果的可能。

目前MLST数据库中，已经收录了SP 4000多种ST，这些数据可以供全球不同实验室之间进行结果的分析对比，而且可以随时补充新的数据，肺炎链球菌分子流行病学监测网（PMEN）利用这些数据将SP分为43个耐药克隆，研究表明不同国家的流行ST和ST克隆群是不同的。在美国，主要流行ST为ST199，ST 克隆群为 M254-15B［28］；在日本，主要流行ST为ST90、ST236和ST242，ST克隆群为Spain6B-2、Taiwan19F-14 和 Taiwab23F-15［29］；在中国，主要流行ST为ST320、ST271和ST876，ST克隆群为 Taiwan19F-14［30］。研究同时表明，不同血清型的流行ST也是不同的。在美国，主要血清型19A的流行ST为ST199［28］；在日本，主要血清型的流行 ST：6B 为 ST90，19F 为 ST236 和ST2993，23F 为 ST242、ST356 和 3ST81［29］；在中国，主要血清型的流行ST：19F为ST271，14为ST876和 ST790，19A 为 ST320，6B为 ST90和ST3263，23F为ST81和 ST342［30］。还有文献报道证实，不同ST的抗生素耐药率也存在差异。例如，在日本，ST90、ST236和ST242构成了36.4%的MRSP［29］；在中国，ST320和 ST271则构成了儿童IPD中31.0%的多重耐药PMEN克隆群 Taiwan19F-14［30］。另外，PCV7应用后，由于“血清型替换”，19A型SP大量出现，在某些国家，如美国和中国，19A甚至成为了主要血清型，在多数国家19A的大量出现与ST320的播散有关，在美国则是ST199播散的直接结果。

MLST还可用于基因变异率的评估和非典型菌株的鉴定。研究发现，SP的7个管家基因中，以xpt的变异率最高，这是新型ST不断涌现的重要原因之一。Ing等［31］还曾用 MLST对非典型菌株进行定型，并与目的基因ply、psa A的PCR结果相互参照，实现了非典型SP的鉴定。

五、展望

SP感染严重威胁着儿童的健康，积极防治PD将加速联合国千年发展目标的实现。避免抗生素滥用是目前公认的较好的控制SP耐药发生和发展的主要途径。除此之外，建立细菌耐药监测网，并借助于MLST等分子生物学的方法追踪细菌的耐药起源和播散途径，可以为临床更好的控制SP耐药性的发生和发展提供有力的依据。SP疫苗的有效性已经得到证实，但是由于SP血清型分布的人群和地域差异，不同地区应用后的效果还有待于进一步的评估。“血清型替换”是降低SP疫苗效能的主要原因之一，非疫苗覆盖的血清型在耐药率方面也出现了不利的一面，这些方面的研究都有待于进一步的展开。

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Advance in the epidemiological researches ofStreptococcuspneumoniae

ZH ANGTiandong，ZHANGHong. （DepartmentofClinicalLaboratory，ShanghaiChildren′sHospital，ShanghaiJiaotongUniversity，Shanghai200040，China）

R378.1

A

1009-7708（2012）06-00472-05

上海市自然科学基金（09ZR14275）。

上海市儿童医院，上海交通大学附属儿童医院检验科，200040。

张天栋（1986—），男，在读硕士，主要从事细菌耐药机制及分子流行病学研究。

张泓，E-mail：zhanghong3010＠126.com。

2012-05-14

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