Illumina测序技术在母血检测胎儿非整倍体中应用

冯穗华，王 威，黄泳华，陈 芳，蒋馥蔓，李卫凯，麦巧娇，瞿京辉，张燕玲，张红云，陈建勇

（1.江门市中心医院 产科，广东 江门 529000；2.深圳华大基因研究院）

Illumina测序技术在母血检测胎儿非整倍体中应用

冯穗华1，王 威2，黄泳华1，陈 芳2，蒋馥蔓2，李卫凯1，麦巧娇1，瞿京辉2，张燕玲1，张红云2，陈建勇1

（1.江门市中心医院 产科，广东 江门 529000；2.深圳华大基因研究院）

目的 研究Illumina测序技术在母血中检测胎儿非整倍体的可行性，及其在无创性产前诊断中的应用前景。方法68例孕12－39周具有产前诊断指征的单胎妊娠孕妇抽取外周血进行离心、提取血浆中游离DNA，运用Illumina Hiseq2000测序技术进行DNA测序及统计分析。结果68例孕妇通过Illumina测序技术检测出3例21三体，2例18三体、1例13三体及1例47，XYY。因为濒死胎儿羊水脱落细胞活力极低而致羊水培养失败，传统型染色体核型分析未检测出1例21三体。结论Illumina测序作为一种无创性产前诊断技术，可准确地筛查21、18、13、X、Y等染色体非整倍体异常，具有安全、准确率高及假阳性率低的优点，值得临床推广。

Illumina测序；无创性产前诊断；非整倍体；胎儿

（ChinJLabDiagn，2012，16：1213）

我国每年将增加近100万出生缺陷儿童，占世界每年出生缺陷发生总数的20%左右，给社会和家庭带来沉重的精神负担，目前通过产前筛查及产前诊断系统，并采取终止妊娠方式减少病患儿出生是有效的预防手段。传统通过绒毛活检、羊膜腔穿刺、脐带穿刺采集胎儿标本的有创性检查具有一定的流产、早产及宫内感染的风险，因此寻找并建立早期、快速、准确且无创的产前诊断方法是目前临床亟待解决的难题。本研究通过分离母体外周血中的胎儿游离DNA，利用新一代高通量Illumina测序技术进行测序，分析胎儿染色体非整倍性变化达到无创性产前诊断的目的，现将相关研究报道如下：

1 资料与方法

1.1 研究对象

选择2010年2月至2011年1月在我院产科就诊，妊娠12－39周的单胎妊娠孕妇68例，年龄22－43岁，本组孕妇均有羊水检查或脐血检查胎儿染色体指征（高龄、唐氏筛查高风险、超声异常、不良孕产史或患者夫妇之一染色体异常等）。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂和仪器 DNA 提取：QIAamp DNA Micro Kit（Qiagen，Hilden，Germany）；文库制备试剂：Genomic DNA Library Preparation Kit（（Illumina），Multiplexing Sample Preparation Oligonucleotide kit（Illumina）；测序：Hiseq2000；Sequencing Kit V3 （Illumina）；数据 分 析：Efficient Large-Scale Alignment of Nucleotide Databases（ELAND）；染色体核型分析：Aloka SSD-3500SX 超声诊断仪及VideoTesT-Karyo全自动染色体核型分析系统

1.2.2 步骤

①签署知情同意书后，EDTA管采集8－10ml孕妇外周血。4℃1 600g离心10min，分离血浆，再4℃16 000g离心10min去除残余细胞，抽取血浆3－5ml，置于离心管内－80℃保存。

②提取血浆中游离DNA，在血浆游离DNA片段的两个末端加上接头，构建DNA文库。

③Illumina新一代测序技术测序，利用专利的芯片，制备DNA簇，边合成边测序，自动读取碱基，数据被转移到自动分析通道进行二次分析，根据公式［1］：某染色体含量（%Chr N）＝某染色体唯一序列读取数／参考序列染色体N上基因组唯一序列总数；测试样本Chr N的关联Z-Score＝（%chr N检测样品 –%chr N对照组平均值）／S.D.%chr N对照组，计算每条染色体的Z-score值，Z-score值≥3为非整倍体高风险标本，-3＜Z-score值＜3为非整倍体低风险标本，给出分析报告。

④本组孕妇孕16周后抽取羊水或脐血行胎儿染色体分析，判断本研究结果的准确性。

2 结果

2.1 羊水及脐血染色体结果

68例孕妇中1例孕19周21三体筛查高风险（风险值1：2），羊水深褐色，胎心80次／分，羊水穿刺术后胎儿2小时死亡病例，羊水培养失败。其余67例均培养成功，检查结果21三体2例，18三体2例，13三体1例，13单体嵌合部分13环状染色体1例，9号倒位1 例，47，XYY1例，46，XX，14PS＋1例，正常染色体核型58例。

2.2 Illumina测序结果

68例孕妇外周血均成功提取DNA，根据测序及统计每条染色体的Z-score值所得出的结果分析，检测出3例21三体（其中1例唐氏筛查1：2，羊水培养失败的胎儿，经检测为21三体），2例18三体，1例47，XYY，1例13三体，其余样本检测结果未见异常。

3 讨论

由于传统的唐氏筛查包括早孕期血清学联合NT筛查及中孕期血清学筛查，其检出率低，假阳性率高达5%，受孕周影响，仅可以在孕11－21周进行筛查，而有创性产前诊断具有一定的流产率，随着医学伦理学及医学生物技术的不断完善，无创性产前诊断已经得到越来越多的关注。

3.1 母体胎儿游离DNA来源

母体胎儿游离DNA来源于胎盘滋养细胞、孕妇血液中游离胎儿细胞及胎儿组织发育过程中自然凋亡的 DNA［2，3，4，5］。1997年 Dennis Lo［6］在母体血浆中检出胎儿游离DNA，在孕5周开始随着孕周的增加母体中游离DNA浓度相应增加［7］，分娩后2小时迅速降解消失，其半衰期为4～30min［8］。Bischoff［9］等报道胎儿DNA占孕妇血浆中总DNA的5－7%，这一重大发现为无创性产前诊断的发展奠定了基础。

3.2 Illumina高通量测序技术筛查胎儿非整倍体原理

孕妇血浆中胎儿DNA含量低，需要选择超级灵敏的分子生物技术才可以对胎儿游离DNA进行判断。Illumina测序技术为新一代测序技术，具有高通量DNA测序能力，可以测定样本中的基因组信息和数以百万计的DNA分子数量，判断母血中微量胎儿异常DNA扰动。Illimula测序技术对母体血中所有游离DNA（包括胎儿游离DNA）进行基因测序，根据人类基因组的不同染色体上的特定位点和唯一基因序列片段特征，通过比对获得所测得的每条序列的位置信息，定位到相应的染色体上，并根据统计获得分布在每条染色体上的序列条数，由此计算n染色体所占比率。含有非整倍体胎儿DNA的母血样本，其异常染色体上的序列条数比正常二倍体的样品的多，应用生物信息工具，放大并分析外周血中不同染色体含量的差异，从而精确识别胎儿染色体非整倍体异常。

3.3 Illumina测序技术检测非整倍体的准确性及优点

2008年Fan HC等［10］利用新一代测序技术对孕妇血浆内胎儿游离DNA进行测序，通过统计分析正确区分了9例21三体、2例18三体和1例13三体；Chiu RW等［10］在2008年也利用了新一代测序技术对血浆内游离DNA进行测序，通过Z-score模型分析数据，正确区分了14例21三体。而在我们的研究中，经过与羊水、脐血染色体比对，正确区分了2例21三体，1例18三体，1例47，XYY。值得一提的是，本研究有1例羊水培养失败，原因是由于胎儿濒死且羊水呈墨绿色，羊水中脱落细胞的活力降低，羊水细胞不能贴壁生长，但Illumina测序技术将其DNA片段提取、测序并分析，证实为21三体儿，弥补了羊水培养的缺点，凸显其诊断的优越性。Illumina测序技术检测非整倍体具有以下优点［1，10，11］：（1）无创伤，无流产及感染风险；（2）该检测技术可以用于检测21、18、13、X、Y等染色体非整倍体，准确率高达99%以上；（3）受孕周影响小，可检测孕12周以上的妊娠；（4）检测周期短；（5）可作为一种产前筛查技术，极低的假阳性率可大幅降低创伤性产前诊断比例，缓解临床压力。

3.4 Illumina测序技术的缺点

本研究中染色体核型为13单体嵌合部分13环状染色体、9号倒位、14PS＋的病例在新一代测序技术中，结果显示均为正常。因为检测的是游离DNA中的碱基序列片段，对于无碱基序列增多或减少的平衡易位及嵌合体、环状染色体等染色体异常，Illumina测序不能精确检测出来，同理不能精确检测非单绒毛膜性质的多胎妊娠。对于孕妇前期接受过异体输血、移植手术、干细胞治疗者，因为引入外源性DNA，也会影响检测结果。

综上所述，Illumina测序可准确地筛查21、18、13、X、Y等染色体非整倍体异常，具有安全、准确率高及假阳性率低的优点，取代传统的唐氏筛查方法是可行的。但由于本研究的样本量小，需要加大样本进一步研究，达到应用临床的目的。

致谢：深圳华大基因研究院完成所有的样品的DNA文库、DNA测序、生物信息分析基因测序及统计分析工作，作为其合作单位之一，我们对此致以深切感谢！

［1］Chiu RW，Chan KC，Gao Y，et al.Noninvasive prenatal diagnosis of fetal chromosomal aneuploidy by massively parallel genomic sequencing of DNA in maternal plasma［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2008，105（51）：20458.

［2］Bianchi DW.Circulating fetal DNA：its origin and diagnostic potential-a review［J］.Placenta，2004，25Suppl A：S93.

［3］Sekizawa A，Samura O，Zhen DK，et al.Apoptosis in fetal nucleated erythrocytes circulating in maternal blood［J］.Prenat Diagn，2000，20（11）：886.

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［5］费明钰，张 毅，贾 音，等.母血中胎儿遗传物质与无创性产前诊断［J］.分子诊断与治疗杂志，2011，2（6）：428.

［6］Dennis Lo YM，Chiu RW.Prenatal diagnosis：progress through plasma nucleic acids［J］.Nat Rev Genet，2007，8（1）：71.

［7］Lo YM.Recent developments in fetal nucleic acids in maternal plasma：implications to noninvasive prenatal fetal blood group genotyping［J］.Transfus Clin Biol，2006，13（1-2）：50.

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Detecting fetal chromosomal aneuploidy by Illumina-solexa sequencing DNA in maternal plasma

FENGSui-hua，WANG Wei，HUANGYong-hua，etal.（DepartmentofObstetrics，JiangmenCentralHospital，Jiangmen529000，China）

ObjectiveTo study the feasibility of detecting fetal chromosomal aneuploidy and the perspective of noninvasive prenatal diagnosis by Illumina sequencing DNA in maternal plasma.Methods68singleton pregnant women with gestation weeks of 12－39were recruited.Maternal plasma DNA was extracted and sequenced on Illumina／Hiseq2000platform for subsequent statistics analysis.ResultsThree cases of trisomy 21，two cases of trisomy 18，one cases of trisomy 13，one cases of 47，XYY were successfully indentified by Illumina sequencing.One case of trisomy 21 wasn’t detected in traditional karyotyping analysis because the cell of amniotic fluid had exceeding low vitality in the dying fetus.ConclusionAs a kind technique of noninvasive prenatal diagnosis，Illumina sequencing Of maternal plasma DNA was effective in identifying fetal chromosomal aneuploidy such as 21，18，13，X，Y.Considering its accuracy and security，it Would be worth spreading in clinic.

Illumina sequencing；noninvasive prenatal diagnosis；aneuploidy；fetus

R714.3

A

1007－4287（2012）07－1213－03

2011－08－07）