生物安全三级实验室甲醛熏蒸消毒灭菌效果评价

李研，陈省平，赖小敏，王聪，王娟，袁广卿，彭毅

生物安全三级实验室是按照我国《病原微生物实验室生物安全管理条例》[1]和《实验室生物安全通用要求》（GB19489-2008）[2]等有关病原微生物实验室生物安全法规和标准，以及 WHO《实验室生物安全手册》（第三版）[3]中的三级生物安全（biosafty level 3，BSL-3）防护标准建立的病原微生物实验室，是专门针对通过气溶胶或其他途径传播，可导致严重后果或生命危险的内源性和外源性病原而特设的适用于临床、诊断、教学、科研的设施。高级别生物安全实验室中所研究的病原体大多数具有气溶胶感染的特性[4]。随着经济的高速发展和近年来传染性非典型肺炎（又称严重急性呼吸综合症，severe acute respiratory syndromes，SARS）和高致病性禽流感等疾病的暴发流行，实验室生物安全问题受到了社会各界的广泛关注[5]。如何避免实验室生物安全问题的产生已成为科研人员高度关注的问题。实验室的消毒、灭菌是关键之一。目前，生物安全实验室多采用物理及化学的方式来杀灭实验室内微生物或其他有害病原体。物理的消毒方法主要有紫外线照射、干热灭菌、压力蒸汽灭菌、高效空气过滤器（high efficiency particulate air filter，HEPA 过滤器）过滤等。其中紫外线消毒是大多数普通生物实验室采用的消毒方法，但紫外线消毒受很多因素影响，如管理意识、辐射强度、灯管的使用与保养等[6]。化学消毒是使用消毒剂来杀灭病原微生物。在化学消毒剂中，甲醛熏蒸因为具有广谱杀菌、使用方便和价格低廉等优点，已成为国内最为普遍的消毒、灭菌方法[7]。尤其在从事结核分枝杆菌研究的生物安全实验室中有气溶胶传播的特性，采用甲醛熏蒸能针对悬浮在空气中的小颗粒气溶胶进行消毒、灭菌。甲醛消毒原理是使病原体蛋白质凝固、还原氨基酸、使蛋白质分子烷基化等[8]。我们按照上述国内外法规、指南和标准，以及本实验室《生物安全三级实验室消毒灭菌手册》对实验室进行消毒，用平板培养法和聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）检测法进行消毒效果检测和验证。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 培养基 自制普通营养琼脂培养基，置于直径 9 cm平皿中，经 37 ℃ 24 h 培养验证无菌后 4 ℃ 保存备用。

1.1.2 试剂 甲醛购自广州化学试剂厂，纯度为 37%，用单蒸水配制成 36% 甲醛溶液；DNA 抽提试剂盒购自美国Omega bio-tek公司；Taq DNA 聚合酶、Mg2+购自美国Promega 公司；核酸分子量 marker 购自广州东盛生物科技有限公司。

1.1.3 主要仪器 F-50 型甲醛熏蒸器购自北京克力爱尔生物有限公司；FORMA3111 型二氧化碳水套式培养箱购自美国 Forma 公司；VERITI96-WELL 型 PCR 仪购自美国 ABI 公司；G:BOXEF 凝胶成像系统购自英国 Syngene公司。

1.2 方法

1.2.1 实验室消毒 按房间体积计算，以 15 ml/m3比例计算出 36% 甲醛溶液的用量，将定量的甲醛溶液和中和剂氨水分别加入甲醛发生器内相应的 A 和 B 槽。按照WHO《实验室生物安全手册》（第三版）要求，将实验室室内温度调节高于 25 ℃，相对湿度在 70% 左右。确认实验室内无工作人员后，关闭消毒区域与外界相通的门和传递窗，以及中央送风系统，遥控启动甲醛发生器进行熏蒸。房间熏蒸 8 h 以上。熏蒸后不立即通风，房间密闭 24 h 后，打开通风系统置换新鲜空气，直至闻不到刺鼻甲醛气味。

1.2.2 消毒灭菌效果平板培养法检测 实验室消毒后，用5 个 9 cm 普通平板培养基对实验室内空气沉降 15 min采样。分别置于实验室的 4 个角落以及中央位置，相当于人的呼吸道高度[9]。将采样后的平板置于 37 ℃ 培养箱培养 48 h 后，计数菌落数量。

1.2.3 结核分枝杆菌 PCR 特异性检测 对实验室内易污染部位进行甲醛熏蒸消毒前后采样对比，包括：实验室门把手、实验台面、生物安全柜门把手、显微镜调节旋钮、二氧化碳培养箱门把手、冰箱门把手、传递窗按钮以及高压灭菌器开关及把手等。用浸有无菌生理盐水的棉签往返5 次擦拭各采样点后，将棉签浸入采样管中。所有采样标本用 DNA 试剂盒抽提 DNA 后进行 PCR 扩增。PCR 引物序列为：上游引物 5' CAGTGGAATTTCGCGGGTATC 3'，下游引物 5' CGTTGTTCAGCTCGGTAGCC 3'，可特异性扩增 200 bp 左右的结核分枝杆菌早期分泌蛋白 6（ESAT-6）基因片段。PCR 反应体系包含 cDNA 1 μl，dNTP mix（10 mmol/L）0.5 μl，上下游引物各 1 μl（10 μmol/L)，Taq DNA 聚合酶 0.125 μl（5 U/μl），Mg2+（25 mmol）3 μl 和5 × PCR buffer 5 μl，加重蒸水至 25 μl。反应条件：95 ℃5 min；94 ℃ 40 s，60 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min，循环 35 次；最后 72 ℃ 7 min 终止反应。实验设置阳性和阴性对照。以 1% 琼脂糖凝胶电泳鉴定 PCR 产物，凝胶成像仪下观察记录结果。

2 结果

2.1 普通平板培养菌落计数

平板培养后计数结果显示，实验室 4 个角落及中央位置菌落数分别为 0、2、1、0、0。符合生物安全三级实验室的消毒灭菌要求。

2.2 PCR 扩增结核分枝杆菌基因片段结果

图 1 为消毒前 PCR 扩增结核分枝杆菌基因片段结果。阳性对照（2 号加样孔）和生物安全柜操作台面（4 号加样孔）有约为 200 bp 左右的阳性扩增片段，其余各取样扩增管（3、5 ～ 10 号加样孔）及阴性对照（1 号加样孔）未见阳性扩增片段，说明熏蒸前实验操作台面有污染。

图 2 为熏蒸后 PCR 扩增结核分枝杆菌基因片段结果。阳性对照（2 号加样孔）可见 200 bp 左右的扩增片段，但各取样扩增管（3 ～ 10 号加样孔）及阴性对照（1 号加样孔）未见扩增片段，说明熏蒸消毒、灭菌后各取样点未检测到结核分枝杆菌核酸序列，提示实验室已无细菌污染，达到消毒灭菌效果。

3 讨论

图 1 熏蒸前 PCR 扩增结核分枝杆菌基因片段结果

图 2 熏蒸后 PCR 扩增结核分枝杆菌基因片段结果

目前生物安全三级实验室通过送排风系统并经过初、中、高效过滤器过滤，保证了实验室内空气洁净度为万级到十万级；同时辅助工作区与缓冲间之间，以及缓冲间与核心实验室之间形成国家标准要求的负压（递增）梯度现状，能够为实验室内工作人员提供有效的生物防护。但在开展实验活动时难免会有操作台面等的污染。因此，我们进行了甲醛熏蒸消毒灭菌效果验证的系统研究。通过琼脂平板培养实验和 PCR 检测验证了甲醛熏蒸消毒的有效性。前者根据消毒灭菌操作后实验室空间普通细菌残留的数量间接检测消毒灭菌的效果，但由于受实验室本身洁净度等因素的影响，这种方法只能作为消毒灭菌效果验证的初步和补充方法；而后者由于能特异性检测所操作的病原体核酸，具有方法简便、快速、特异、敏感等特点[10]，可作为实验室空间及仪器设备污染与否和消毒灭菌效果验证最为准确的方法，实际操作时可选择在每次、周、月实验结束清场（消毒灭菌）后定期和不定期，以及一个实验周期结束后终末消毒灭菌效果验证时进行。应注意取样点的代表性和完整性，同时定期和不定期配合使用特定病原体的培养方法作补充。甲醛是一种高效的消毒剂，可通过熏蒸发生，使用起来简单、方便、有效，对消毒物品无损害。但由于甲醛消毒效果受消毒环境的温度、湿度、工作浓度以及熏蒸时间等因素的影响[4]，因此，在消毒时要严格控制条件以达到良好的消毒、灭菌效果。此外，因甲醛消毒后会有残留，要注意人工擦拭去除表面的微量残留[8]。实际使用时还要注意根据所消毒物品的性质和空间大小（如实验室房间、生物安全柜等）的不同，选择适合的，不同规格、型号、能产生足量蒸汽的甲醛发生器。

[1] The State Council of People’s Republic of China. The regulation of biological safety of pathogenic micro-organism laboratory. 2004-11-12. (in Chinese)中华人民共和国国务院. 病原微生物实验室生物安全管理条例.2004-11-12.

[2] China National Accreditation Committee for Laboratories. GB 19489-2008 Laborotories-general requirements for biosafety. Beijing:Standards Press of China, 2008. (in Chinese)中国实验室国家认可委员会. GB 19489-2008 实验室生物安全通用要求. 北京: 中国标准出版社, 2008.

[3] World Health Organization. Laboratory biosafety manual. 3rd ed.Geneva: World Health Organization, 2004. (in Chinese)世界卫生组织. 实验室生物安全手册. 3版. 日内瓦: 世界卫生组织, 2004.

[4] Bi JJ, Wang Z, Chen JJ, et al. Safe disposal of wastes from high-level biosafety laboratories. Bull Acad Mil Med Sci, 2006, 30(4):394-397.(in Chinese)毕建军, 王壮, 陈洁君, 等. 高级别生物安全实验室废弃物安全处置. 军事医学科学院院刊, 2006, 30(4):394-397.

[5] Wang QD. Management of the laboratory biosafty of our country.Chin Med Biotechnol, 2007, 2(1):6-8. (in Chinese)王秋娣. 我国实验室生物安全管理. 中国医药生物技术, 2007, 2(1):6-8.

[6] Li MJ, Yuan Z, Liu J, et al. Influencing factors of ultraviolet ray disinfection in the laboratory for cell culture and its countermeasures.Lett Biotechnol, 2010, 21(3):453-454. (in Chinese)李盟军, 袁征, 刘剑, 等. 影响细胞培养实验室紫外线消毒效果的因素及对策. 生物技术通讯, 2010, 21(3):453-454.

[7] Han YQ, Liu YJ. Study on the action of the multiple factors influencing disinfection efficacy of formaldehyde fumigation.Disinfection Sterilization, 1989, 6(3):132-138. (in Chinese)韩友圻, 刘育京. 甲醛熏蒸消毒多因素影响作用的研究. 消毒与灭菌, 1989, 6(3):132-138.

[8] Xia DS, Chen HJ. Study on disinfection residual effect verification and validation method of formaldehyde. Shanxi Med J, 2011,40(7):720-721. (in Chinese)夏德生, 陈慧娇. 甲醛消毒效果验证及残留验证方法研究. 山西医药杂志, 2011, 40(7):720-721.

[9] Wang QS, Zhou ZM, Gao Y. Practical handbook of medical media.Beijing: People’s Military Medical Press, 1999. (in Chinese)王钦升, 周正明, 高屹. 实用医学培养基手册. 北京: 人民军医出版社, 1999.

[10] Wu HH, Ye ML, Li XD. Screening of random primer and optiming of reaction system for arbitrarily primed polymerase chain reaction on 8 sorts of bacteria. Chin J Nosocomiol, 2003, 13(12):1104-1106. (in Chinese)吴海寰, 叶明亮, 李晓娣. 细菌随机引物聚合酶链反应分析中随机引物的筛选与反应体系的优化. 中华医院感染学杂志, 2003, 13(12):1104-1106.