Toll样受体4对巨噬细胞脂周素2表达的影响

范 斌， 韩 冬， 谷剑秋， 冯 娟

动脉粥样硬化是脑血管病的病理基础，而泡沫细胞的形成是动脉硬化的早期事件［1］。多种因素参与泡沫细胞形成。其中细胞内脂肪滴表面蛋白成为近年研究的热点。PAT家族蛋白是细胞内脂肪滴表面主要结构蛋白。目前发现的成员包括脂周素1(perilipin1)、脂周素2(perilipin2;又名adipose differentiation-related protein，ADRP)、脂周素 3(perilipin3;又名 TIP47)。

其中脂周素2在泡沫细胞和动脉硬化斑块中选择性高表达［2，3］。研究表明“敲除”或“沉默”脂周素2基因，可减少巨噬细胞对游离脂肪酸及胆固醇的摄取，进而抑制泡沫细胞的形成，阻止动脉粥样硬化的发生和发展。故脂周素2是抑制泡沫细胞形成作用药物的关键靶点［4］。但目前对脂周素2表达的调控机制研究却较少。

Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)可以被病原体相关分子模式(pathogen-associated molecule patterns，PAMP)识别。目前发现人TLR家族包括12名成员，其中TLR4信号传导通路参与泡沫细胞形成［5，6］。但关于 TLR4调节泡沫细胞形成机制仍未明确。鉴于脂周素2在泡沫细胞形成中的重要作用，因此本研究检验TLR4信号传导通路对脂周素2表达的影响，并揭示其作用的分子机制。

1 材料和方法

1.1 主要试剂LPS(Sigma，美国)，放线菌素D(Sigma，St.Louis，MO)，c-Jun NH2-terminal kinase(JNK)inhibitor II(JNKI)(Calbiochem La Jolla，CA)，脂周素2单克隆抗体(Progen Biotechnik，德国)，GAPDH单克隆抗体，过氧化物酶偶联羊抗豚鼠IgG及羊抗鼠抗体(Santa Cruz Biotechnology，美国)，Western blotting检测试剂盒(GE Healthcare)，转染试剂，Lipofectamine Plus Reagent(Invitrogen)，荧光素发光检测试剂盒(Promega)，逆转录ReverTra Ace-a kit试剂盒(Toyobo，Osaka 日本)，Real time PCR SYBR Green试剂盒(Bio-Rad)，空白 pGL3荧光素酶报告质粒，包含脂周素2启动子-2090bp区域的pGL3质粒，对照pRL-TK质粒由日本九州大学生山祥一郎教授慷慨提供。

1.2 细胞培养 RAW264.7鼠巨噬细胞株(RIKEN，日本)，1 ×106接种于10mlα-MEM 培养基中(100ml/L胎牛血清，1×105U/L青霉素)，置于37℃、CO2恒温培养箱中，1～2d传代一次。

1.3 Real-time PCR 使用Isogen，按说明书提取总 RNA，取0.5μg/ml总 RNA，用逆转录 ReverTra Ace-a kit试剂盒，按使用说明书操作合成单链cDNA，鼠脂周素 2上游引物序列 5’-CTGTCTACCAAGCTCTGCTC-3’，下游引物序列 5’-CGATGCTTCCTTCCACTCC-3’。GAPDH，上游引物序列为5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’，下游引物序列为5’-TCCACCACCCTGTTGCTTA-3’，用 SABR Green Real-time PCR荧光试剂盒，按说明书操作，以GAPDH为内参照物，脂周素2量以对GAPDH相对诱导倍数表示。

1.4 Western blotting 用4℃预冷裂解液(含pH 7.5 的 50mmol/L Tris-HCl、0.5g/L Nonidet 40、1mmol/L EDTA、1mmol/L EGTA、150mmol/L NaCl、100ml/L甘油、50mmol/L氟化钠、10mmol/L焦磷酸钠、1mmol/L 矾酸钠、80μmol/L β-甘油磷酸、1mmol/L PMSF、10mg/L aprotinin、100mg/L soybean trypsin inhibitor和10mg/L leupeptin)裂解细胞。取25μg蛋白，95℃变性5min后经12%SDS-PAGE行垂直电泳，100V ×90min，室温100V ×100min转膜，50g/L牛奶室温封闭1h。结合一抗(豚鼠抗鼠脂周素2mAb，1∶200稀释) ，室温 1h，结合二抗(羊抗豚鼠，或羊抗鼠多克隆抗体，1∶20000稀释)，室温1h。感光、洗片，蛋白条带扫描后行光密度分析。

1.5 临时转染及荧光素酶活性分析 用Lipofectamine，和PLUS reagent转染试剂，按使用说明书进行操作，细胞2×105/孔，接种于12孔板，培养24h后，改为无血清培养液培养，转染混合液50μl(Lipofectamine 2μl，PLUS reagent5μl，1μg 荧光素酶报告质粒，0.4μg pRL-TK质粒，用无血清培养液调整至50μl)，37℃转染4h。1×PBS洗涤，改为含胎牛血清α-MEM培养液及相应浓度ODN1826培养24h，收集并裂解细胞，使用Dual-Luciferase Reporter Assay System荧光素酶检测系统，按说明书操作进行荧光素酶活性检测。根据对照质粒pRL-TK Renilla活性标准化转染效率。

2 结果

2.1 LPS对巨噬细胞脂周素2表达的影响我们使用LPS，TLR4的配体，检测了TLR4信号传导通路对巨噬细胞脂周素2表达的影响。结果显示，LPS以剂量依赖的方式显著增加了脂周素2mRNA和蛋白的表达水平，由于100ng/m l LPS诱导脂周素2表达最显著且未见毒性作用，因此选用该浓度进行研究。在该浓度下，LPS以时间依赖的方式诱导了脂周素2mRNA和蛋白的表达，刺激24h后表达最明显。

2.2 LPS在转录水平调节脂周素2表达 为进一步研究LPS诱导脂周素2表达分子机制，我们检测了放线菌素D对脂周素2表达的影响。如我们所料，放线菌素D几乎完全抑制了LPS诱导的脂周素2表达，提示LPS是在转录水平调节脂周素2表达。为进一步验证以上结论，我们构造了包含脂周素2启动子区域-2090bp的荧光素酶报告质粒，检测LPS对脂周素2启动子活性的影响，荧光素酶表达分析显示，LPS以剂量依赖方式显著刺激了启动子活性。

2.3 LPS诱导脂周素2表达需要AP-1的活性研究证明TLR4调节的信号通路包括激活AP-1，我们以前在脂周素2启动子区域鉴定存在Ets/AP-1位点，因此我们检测了AP-1抑制剂对脂周素2表达的影响，JNK抑制剂(SP-600125)以浓度依赖方式抑制了LPS诱导的脂周素2表达。

3 讨论

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是引起多种心脑血管疾病的病理基础。巨噬细胞、平滑肌细胞都能转化为泡沫细胞，但巨噬细胞是早期动脉粥样硬化损伤中泡沫细胞的主要来源。研究表明泡沫细胞形成与脂周素2密切相关。脂周素2属脂肪滴周围蛋白PAT家族成员，PAT家族蛋白以脂滴表面为平台对三酰甘油代谢进行调节。越来越多的研究表明，脂滴并不是简单的中性脂质贮存库，而是活跃的细胞器，与细胞多方面的生物功能有关。脂周素2具有多个脂滴结合结构域，分布于几乎所有细胞系中，在发生脂肪变性的肝细胞、巨噬细胞、泡沫细胞、动脉硬化斑块中选择性地高表达［2］。通过对建立脂周素2基因“高表达”巨噬细胞株的研究表明，脂周素2“高表达”促进巨噬细胞对游离脂肪酸及ox-LDL吸收，导致泡沫细胞形成［1］。此外，脂周素2基因“敲除”可抑制泡沫细胞形成并进而阻止动脉粥样硬化的发生发展［4］。

以上研究结果表明，脂周素2在泡沫细胞形成中扮演重要作用，但对脂周素2表达调控机制的研究却较少。

Toll样受体首先在果蝇中发现，哺乳动物包括人类也存在一组结构功能都与Toll样受体同源的结构域，被称为Toll样受体家族。TLR4在巨噬细胞中高表达，参与动脉粥样硬化的形成。内源性或外源性配体刺激TLR4，促使巨噬细胞分泌炎症因子或化学因子，在 ox-LDL的刺激下转化为泡沫细胞［6，7］。鉴于脂周素2在泡沫细胞形成中的重要作用，因此我们研究TLR4信号通路是否可影响脂周素2的表达。

本研究证明，TLR4的配体LPS以浓度及时间依赖方式显著刺激了巨噬细胞脂周素2mRNA及蛋白的表达。100ng/ml LPS诱导最明显的表达，此结果提示脂周素2参与TLR4诱导泡沫细胞形成的过程。

接下来，我们研究了TLR4信号通路诱导脂周素2基因表达的分子机制。首先我们检测了转录抑制剂放线菌素D对脂周素2表达的影响，2.5μg/ml放线菌素D显著抑制了脂周素2的表达，此结果提示TLR4信号通路是通过刺激转录进而直接刺激脂周素2表达的。为验证以上结论，我们检测了LPS对启动子活性的影响，LPS以浓度依赖的方式显著刺激了脂周素2启动子的活性，与对照相比100ng/ml LPS诱导了约8倍的荧光素酶活性，以上结果提示TLR4信号通路至少通过直接方式即直接刺激转录活性进而刺激脂周素2表达。

放线菌素D并没有完全抑制脂周素2表达，提示TLR4信号有可能通过间接方式刺激脂周素2表达。研究表明TLR4信号可刺激多种炎性细胞因子表达，如:IL-6、IL-1α、IFN-β、TNF-α 等，而以上炎性细胞因子正是诱导脂周素2的诱导剂［8，9］。故我们推测TLR4信号有可能通过间接方式即通过刺激炎性细胞因子表达进而刺激脂周素2表达。此推论需要进一步加以证明。

TLR4信号通路可激活多种转录因子，包括AP-1，而我们以前证明脂周素2启动子区域Ets/AP-1位点参与PMA诱导的脂周素2表达，并且AP-1及PU-1选择性结合此位点［10］。故我们检验AP-1抑制剂对脂周素2表达的影响。JNK抑制剂(SP-600125)显著抑制了脂周素2表达。提示LPS诱导脂周素2表达需要AP-1的活性。

总之，我们的研究证明了TLR4信号通路诱导巨噬细胞脂周素2基因表达，并进一步揭示其分子机制。提示脂周素2参与TLR4诱导泡沫细胞形成过程，脂周素2是防治炎症诱导的动脉粥样硬化药物开发的作用靶点。

［1］郭 阳，郑东明，刘晓梅，等.低密度脂蛋白受体基因 NcoⅠ、ApoC-Ⅲ基因SacⅠ多态性与动脉粥样硬化脑梗死关系［J］.中国现代医学杂志，2006，16(5):641-644.

［2］Brasaemle DL，Barber T，Wolines NE，etal.Adipose differentiationrelated protein is an ubiquitously expressed lipid storage droplet-associated protein［J］.JLipid Res，1997，38(5):2249-2263.

［3］Kimmel AR，Brasaemle DL，Mcanfrews-Hill M，etal.Adoption of PERILIPIN as a unifying nomenclature for themammalian PAT-family of intracellular，lipid storage droplet proteins［J］.J Lipid Res，2010，51(3):468-471.

［4］Paul A，Chang BH，Li L，etal.Deficiency of adipose differentiationrelated protein impairs foam cell formation and protects against atherosclerosis［J］.Circ Res，2008，102(12):1492-1501.

［5］Rock FL，Hardiman G，Timans JC，etal.A family of human receptors structurally related to Drosophila Toll［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1998，95(2):588-593.

［6］Michelsen KS，Wong MH，Shan PK，etal.Lack of Toll-like receptor4 ormyeloid differentiation factor 88 reduces atherosclerosis and alters plaque phenotype inmice deficient in apolipoprotein E［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2004，101(29):10679-10684.

［7］Mullick AE，Tobias PS，Curtiss LK.Modulation of atherosclerosis in mice by Toll-like receptor 2［J］.JClin Invest，2005，115(11):3149-3156.

［8］Gu JQ，Lkuyama S，Wei P，etal.Pycnogenol，an extract from French maritime pine，suppresses Toll-like receptor 4-mediated expression of adipose differentiation-related protein in macrophages［J］.Am J Physiol Endocrinol Metab，2008，295(6):E1390-E1400.

［9］Fan B，Ikuyama S，Gu JQ，etal.Oleic acid-induced ADRP expression requires both AP-1 and PPAR response elements，and is reduced by Pycnogenol through mRNA degradation in NMuLi liver cells［J］.Am JPhysiol Endocrinol Metab，2009，297(1):112-123.

［10］Wei P，Taniguchi S，Sakai Y，etal.Expression of adipose differentiation-related protein is conjointly regulated by PU.1 and AP-1 in macrophages［J］.JBiochem，2005，138(4):399-412.