免疫组织化学技术常见问题分析及解决对策

刘华庆

(遵义医学院附属医院病理科，贵州 遵义 563099)

免疫组织化学是利用免疫学反应原理，通过特定的标记抗体来显示组织细胞内或细胞间相应抗原变化规律的一门科学［1］。随着科研工作的深入开展，要求从事开展免疫组织化学的工作人员，要对其试剂生产技术的提高、新抗体不断出现、方法学的不断完善和注重标本处理等变化有足够的了解。显然，这就使得首次接触免疫组织化学的工作者，不可避免碰到除此之外的很多看似简单但能够影响免疫组织化学质量的问题，帮助他们解决这些问题具有一定的实际意义。因此，根据多年的实践经验，现将常见的问题进行分析并提出切实可行的解决对策。

1 抗体选择

抗体是免疫组织化学中最核心的试剂，其质量直接影响免疫组织化学的结果，应尽量选用品牌公司的产品，以确保结果可靠［2］。首先在开题前查找所需抗体，同时应注意:①抗体的动物来源(鼠、兔、山羊等)。一抗的动物来源决定应购买相应的二抗检测试剂盒。②标本对象(人/动物)。一些多克隆抗体如兔抗人、大鼠、小鼠，若是人源性抗体，对人的标本较为敏感，对大鼠、小鼠则不一定表达;一些单克隆抗体，说明书上注明与其它动物有交叉反应，但在实验中不一定做出阳性。因为即使是同一抗体生产厂家生产的抗体也存在批间差，购买抗体时最好买抗所做动物的抗体。③标本的处理形式(冷冻/石蜡)。一般能做石蜡切片的抗体都能做冷冻切片，但能做冷冻切片的抗体不一定能做石蜡切片。

通过试剂供应商确定抗体。有些抗体是某研究所或实验室自己研制的，这些抗体不易购买;有些抗体以前有，但由于该抗体制备难，不稳定或购买者少等诸多因素现在没有生产。故在开题前一定要与试剂公司联系，搞清楚有无所需的抗体，确定有后再开题;若无就应更换检测指标。抗体在有的基础上比较各试剂公司的质量和价格。

2 标本准备

石蜡切片固定液最好用10%中性缓冲甲醛液(甲醛:PBS为1∶9)，固定时间12～24 h，固定时间不宜超过24 h，固定一周后抗原丢失严重，一些抗原几乎不能检测。对回顾性研究选择档案蜡块时，避免选择有凹陷的蜡块以及有大量坏死组织的蜡块;做过冷冻切片的，尽量选择冻剩蜡块而不用冻对蜡块，这样可降低非特异性着色［3］。石蜡切片厚4μm，60℃烤片1～2 h，不能在60℃过夜，时间过长加速组织切片中抗原的氧化;若过夜温度可降至37℃。切片室温或4℃可保存3个月［4］。

冷冻切片最好是新鲜标本立即切片，立即染色。若标本需分批收集，最好是边收集边冷冻保存，液氮(－198℃)可保存半年，低温冰箱(－80～－70℃)可保存3个月。收集的新鲜标本低温保存，一般慢冻快融，在染色前复温直接冷冻切片，冷冻切片－20℃可保存2周。

脱钙组织是口腔和骨科研究生常遇到的标本，常规酸脱钙液对抗原破坏较为严重，故骨组织做免疫组织化学多用乙二胺四乙酸(EDTA)进行脱钙，它对组织破坏极小，不影响染色。但脱钙速度较慢，4℃冰箱中脱钙，每周更换一次脱钙液，若加温至37℃或用微波可加快脱钙速度，缩短脱钙时间。

培养细胞中对于贴附生长型细胞可采用细胞爬片，它优于涂片，能保持细胞的原有形态，厚薄一致;若用涂片，则多数细胞变为圆形，失去原有细胞的形态，且厚薄不均。但悬浮生长型细胞则只能用培养细胞离心涂片。

3 抗原修复

抗原修复常与甲醛固定和石蜡包埋有关，若组织处理没有涉及这两个因素的一般不进行抗原修复。冷冻切片，细胞涂片、细胞爬片、印片多用丙酮、甲醇、乙醇固定，做免疫组织化学时就不需要抗原修复。

甲醛固定石蜡包埋组织也不是一定要进行抗原修复，不修复可以得到满意结果或修复与不修复结果无差别的就不用抗原修复，只有通过抗原修复才能得到稳定满意阳性结果的必须修复。抗原修复方式有酶修复、热修复和两种方式结合的联合修复，热修复方式用得更多一些，热修复方式有微波法、高压锅和水浴法，每种抗原修复方法各有自己的优缺点。在保证结果稳定可靠的前提下，一般细胞膜和大部分细胞质抗原检测用微波法(pH 9．0 Tris－EDTA缓冲液)，细胞核和少部分细胞质抗原检测用压力锅法(pH 6．0柠檬酸盐缓冲液)［5］。需不需要抗原修复，用何种抗原修复方式及修复液，可参照试剂说明书和多查文献资料，但更主要的还在于自己摸索。

4 预实验

预实验的目的是摸索抗体的最佳稀释度、最适合的抗原修复方式及孵育温度、时间等。做预实验时要设计好用什么标本、选择好抗体的浓度、需不需要抗原修复和用哪一种抗原修复方式和修复液等。预实验时先做试剂公司提供的阳性对照片，在保证组织中有待测抗原的前提下去摸索抗体的最佳稀释度和最适合的抗原修复方式等条件;若没有阳性对照片，则从文献上查找该抗原在何种标本高表达，或从实验标本中选出理论上表达高的组织3～5例先进行预实验，最好不要用一例标本或一张切片进行预实验，这样做没有比较，反而浪费时间，选出一例表达好的连续切片作为阳性对照片，与所做的标本同批实验，首先观察阳性对照片是否出现阳性，以排除试剂原因和操作因素。

在未做好预试验的情况下，直接进行大批量标本实验，一旦实验失败，既浪费标本和试剂，又浪费时间。做好预实验，把操作步骤固定下来，整个实验就成功了一大半，做大量实验标本时只是一个重复的过程，先小批量做实验标本，待操作过程熟悉后逐渐加大标本量，这样更节约试剂和时间。

5 结果判断

结果判断前首先要明确阳性信号应表达在组织内哪一种/几种细胞，再明确在这种细胞的具体位置(细胞核、细胞质、细胞膜等)，同时免疫组织化学切片应该是阳性标记强而非特异性背景染色淡或无，并具有阳性对照、阴性对照以及自身对照。

免疫组织化学目前还没有统一的结果判断标准，可根据阳性细胞的染色强度、阳性细胞的百分比分别判断，也可将两者结合起来判断;另外还可用图像分析仪测定其灰度值来进行分析。

总之，在做实验时只要掌握了免疫组织化学的基本原理，对迅速发展的免疫组织化学有充分的了解，并注意解决上述谈及的问题，就可以把免疫组织化学工作做好。

［1］John D Bancroft，Marilyn Gamble．Theory and Practice of Histological Techniques［M］．影印本．北京:北京大学医学出版社，2008．433 －436．

［2］陈杰，郑杰，霍临明．重视免疫组织化学的质量控制和标准化［J］．中华病理学杂志，2005，34(2):65 －66．

［3］刘华庆，黄琼，胡莉．乳腺癌冻对蜡块与冻剩蜡块免疫组织化学染色效果比较［J］．贵州医药，2011，35(7):602－604．

［4］周庚寅．组织病理学技术［M］．北京:北京大学医学出版社，2006．39 －58．

［5］刘华庆，侯文，胡莉．抗原修复方式及修复液PH值对免疫组化染色的影响［J］．贵州医药，2008，32(2):167－168．