组蛋白去乙酰化酶抑制剂SAHA 联合伊马替尼对K562 细胞的协同杀伤作用

刘燕燕，尤良顺，钱文斌，童 茵

(1.郑州市中心医院血液科，河南 郑州 450007;2.浙江大学医学院附属第一医院血液科，浙江 杭州 310003)

Bcr-Abl 融合基因产生于9 号和22 号染色体易位(Ph1 染色体)，这是慢性粒细胞白血病(CML)的特征性分子标志;该现象也发生于30%的急性淋巴细胞白血病(ALL)［1］。Bcr-Abl 融合蛋白能持续激活酪氨酸激酶及其多种下游信号分子，如STATs、AKT、ERK 等［2］，以促进细胞发生恶性转化［3］;此外，它还参与介导了CML 对多种传统化疗药物的耐受［4］，这可能是CML 急性变的主要原因。酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼(IM)是初诊CML 患者的一线治疗药［5］，该药能诱导CML 急性变和Ph1 阳性ALL患者获得完全缓解;但是有部分患者由于基因扩增或者位点突变对IM 耐药［7］。为此，研究者正在探索IM 与其他药物联合治疗的策略。一些体外研究表明，IM 与Flavopiridol、MAPK抑制剂及组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂等联用均展现出了协同作用［7-9］。

HDAC 抑制剂是一组能够抑制组蛋白去乙酰化酶活性，使靶蛋白恢复乙酰化的小分子抑制剂，它通过减弱DNA 与组蛋白之间的相互作用，使染色质结构疏松，调控特定基因的表达，促进细胞分化，诱导细胞凋亡，达到抗肿瘤目的［10-11］。有研究表明，HDAC 抑制剂可以下调Bcr-Abl mRNA 的表达，通过抑制HDAC6 促进Bcr-Abl 的降解［12］。

本研究旨在探究HDAC 抑制剂SAHA(suberoylanilide hydroxamic acid)是否能够增强IM 的抗CML 作用，以及对细胞凋亡和Bcr-Abl信号通路分子的影响，试图寻找协同作用的潜在机制，为其联合治疗策略提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 SAHA 购自天津彬馨博奥科技有限公司，IM 购自美国Sigma 公司，二者均用DMSO 溶解并配置成1 mg/ml 储存液，-20℃冰箱保存。CML 细胞株K562 由中科院上海细胞库引进，由本所常规保存。RPMI 1640 培养液购自美国Gibco 公司，胎牛血清购自美国Hyclone 公司;四甲基偶氮唑蓝(MTT)和Hoechst 染料为美国Sigma 公司产品;Annexin V/PI 凋亡检测试剂盒购自美国Biouniquer 公司;Western-blot 抗体:内参照β-Actin 购自美国Santa Cruz 公司，PARP、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bcr-Abl、p-Bcr-Abl、STAT5、p-STAT5、JAK2、乙酰化组蛋白H3(Ac-histone H3)和Mcl-1 单克隆抗体均购自美国Cell-Signaling 公司;荧光显微镜购自日本Olympus 公司。

1.2 MTT 比色法检测细胞的生长抑制作用取状态良好的对数生长期的K562 细胞，以3×104/ml 接种于96 孔培养板，每孔200μl，分别加入10、20、40、80 nmol/L 的IM 和(或)0.25、0.5、1、2μmol/L 的SAHA，同时设立对照组，培养72 h 后加5 mg/ml 的MTT 工作液20μl 于各孔，继续培养4 h，250 g/min 离心5 min，吸弃上清后每孔加入200μl DMSO 震荡，使底部蓝紫色甲臜沉淀充分溶解后在酶标仪570 nm 波长处读取吸光度值(A)。抑制率(%)=(1 -实验组平均A 值)/对照组平均A 值×100%。每组设4个复孔，实验重复3次，取平均值为最终结果。

1.3 Hoechst 染色法观察凋亡小体 K562 细胞经过80 nmol/L 的IM 和(或)2μmol/L 的SAHA 处理24 h 后收集细胞，PBS 溶液洗涤3次后将细胞涂至防脱载玻片上，4%多聚甲醛固定30 min，0.5% Trixton-100 的PBS 溶液透化30 min，滴加Hoechst 工作液，避光常温孵育20 min，水平摇床上用PBS 洗涤3次后于荧光显微镜下观察。

1.4 Annexin V/PI 流式细胞术检测凋亡 收集经药物联合处理24 h 的K562 细胞，用预冷PBS 洗涤3次，弃上清，重悬于500μl 1×结合缓冲液中，按照Annexin V/PI 凋亡检测试剂盒说明书的方法操作，加入5μl 的Annexin V-FITC混匀后，再加入5μl Propidium Iodide 混匀，避光、室温反应10 min 后立刻用流式细胞仪(FACS)检测，CellQuest 1.2 分析软件分析结果。

1.5 Western blot 方法检测凋亡相关蛋白 收集经相应药物处理24 h 的K562 细胞，用预冷PBS 洗涤3次，弃上清，根据细胞团块的大小加1×细胞裂解液60～150μl，置冰上30 min，用超声波细胞粉碎机处理(160 W，持续5 s，间隔5 s，循环5次)，4℃、12 000 g/min 离心5 min，取上清液，用BCA 法测蛋白质浓度。取50μg蛋白行SDS-PAGE 分离蛋白，将分离后的蛋白转移至PVDF 膜上，5%脱脂牛奶室温封闭2 h，分别加入1∶1 000稀释的相应抗体，4℃过夜，用含0.05% Tween20 的TBS(TBST)洗3次，加入1∶5 000稀释的二抗室温水平摇床2 h，TBST 洗涤3次，加入ECL 工作液显影。

1.6 统计学处理 采用SPSS 16.0 统计软件包对数据进行整理分析。计量资料用表示，多组均数间比较采用One way ANOVA，两组均数间比较用t 检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SAHA 联合IM 对K562 细胞的协同杀伤作用 MTT 法检测结果显示，单独用IM(10～80 nmol/L)或SAHA(0.25～2.0μmol/L)处理K562 细胞72 h 后能够抑制其增殖，抑制率分别为(96.9±1.2)%、(90.1±5.0)%、(83.2±1.3)%、(58.7±3.3)% (F=54.14，P＜0.001)和(99.2±0.2)%、(96.2±2.4)%、(70.8±3.5)%、(36.0±2.4)%，呈剂量依赖性(F=433.8，P＜0.001)。联合处理组在IM(20～80 nmol/L)、SAHA(0.5～2.0μmol/L)的浓度范围内与单药组相比，抑制K562 细胞增殖作用显著增强(P＜0.05);经过CalcuSyn 软件计算，其联合指数(CI)＜1，证明SAHA 联合IM 对K562 细胞有协同杀伤作用(图1)。

图1 SAHA 联合IM 对K562 细胞的协同杀伤作用Fig.1 SAHA and imatinib have a synergistic growth inhibitory effect on K562 cells

2.2 SAHA 增强IM 诱导的K562 细胞的凋亡为研究SAHA 和IM 对K562 细胞的诱导凋亡情况，本研究采用Annexin V/PI 染色、FACS检测凋亡，结果显示，SAHA(2μmol/L)、IM(80 nmol/L)单独处理组以及两药联合处理组的早期凋亡率分别为(51.43±3.75)%、(3.82±1.19)% 和(64.47±2.87)%，与 对 照组(3.28±1.23)% 比，单独应用IM 不能诱导K562 细胞凋亡(P ＞0.05)，单用SAHA 能诱导细胞凋亡(P＜0.01)，联合组细胞凋亡明显增加(P＜0.05)。运用Hoechst 染色法从形态学上检测凋亡小体(图2A)，结果显示与FACS 分析结果一致。Caspase 通路激活是凋亡事件的核心机制。用80 nmol/L 的IM 和(或)2μmol/L 的SAHA 处理K562 细胞24 h 后收集蛋白，并行Western blot 检测，结果显示(图2B)，IM单独处理组的凋亡相关蛋白PARP、Caspase-3、Caspase-8 和Caspase-9 未见明显的激活，SAHA单独处理组的上述蛋白均有激活，而在两者联合处理组中，PARP、Caspase-3 和Caspase-8 的激活较单用SAHA组明显增强，Caspase-9 的激活则未见明显增强。通过测定Western blot 条带的灰度值，与单药组相比，联合组Caspase 信号分子激活带显著高表达(P＜0.01，表1)，表明联合处理组较单药组更能增强对K562 细胞的诱导凋亡。

图2 SAHA 增强IM 诱导的K562 细胞凋亡Fig.2 SAHA and imatinib cooperatively induce apoptosis in K562 cells

表1 各组Western blot 图像灰度值比值分析Table 1 Comparison of gray values of Western blot images among different drug treatments(，n=3)

表1 各组Western blot 图像灰度值比值分析Table 1 Comparison of gray values of Western blot images among different drug treatments(，n=3)

2.3 SAHA 和IM 对Bcr-Abl 及下游相关信号分子的影响 为了探索联合用药协同作用的机制，用80 nmol/L 的IM 和(或)2μmol/L 的SAHA 处理K562 细胞24 h 后提取总蛋白，Western blot 检测Bcr-Abl 蛋白表达及其磷酸化水平(p-Bcr-Abl)和JAK2、p-STAT5 的表达;同时还检测了Mcl-1 的表达。结果显示，低剂量IM 和SAHA 单独对Bcr-Abl 影响较小，能轻微抑制p-Bcr-Abl;联合处理后，Bcr-Abl 及其磷酸化水平显著下调，对JAK2、p-STAT5 和Mcl-1 表达的抑制也有类似的作用。此外，联合用药还能提高K562 细胞组蛋白乙酰化(H3)的水平(图3)。通过灰度值比值分析，与单药组相比，联合组蛋白改变更为显著(P＜0.01，表2)。

表2 各组Western blot 图像灰度值比值分析Table 2 Comparison of gray values of Western blot images among different drug treatments(，n=3)

表2 各组Western blot 图像灰度值比值分析Table 2 Comparison of gray values of Western blot images among different drug treatments(，n=3)

图3 SAHA 联合IM 对Ac-histone H3、Bcr-Abl及下游相关信号分子的影响Fig.3 Effects of SAHA and imatinib on Achistone H3、Bcr-Abl signaling in K562 cells

3 讨论

IM 治疗CML 慢性期患者，多数能获得完全细胞遗传学反应(CGCR)，甚至完全分子生物学反应(CMR);但仍有患者能检测到Bcr-Abl，提示IM 不能清除白血病干细胞。IM 治疗CML 晚期患者5年CGCR 只有57%，急变期患者细胞遗传学反应率只有6%～18%［13］。本研究结果显示，低剂量IM 和SAHA 联合能显著抑制 K562 细胞生长、诱导细胞凋亡。Western blot 结果显示，联合处理组中PARP、Caspase-3、Caspase-8 的激活较单用SAHA组明显增强，提示联合用药激活外源性Caspase 途径。与文献报道HDAC 抑制剂激活外源性凋亡途径促进肿瘤细胞发生凋亡结果一致［14］。更为重要的是，联合用药能抑制Bcr-Abl 蛋白表达，对磷酸化Bcr-Abl 的抑制更为明显。本研究结果提示，IM 联合SAHA 可能是治疗对IM 反应不佳的患者的一种新的治疗策略，如晚期慢性期、加速期和急变期患者。

Bcr-Abl 的持续活化是IM 耐药的主要机制之一，其与下述信号途径异常激活有关:①RAS/MAPK 激活;②STAT 磷酸化水平增高导致转录水平增加;③PI3K/AKT 激活使得细胞凋亡减少［13，15］。本研究发现，IM 和SAHA 联合处理K562 细胞能抑制JAK2 蛋白表达，下调磷酸化STAT5，这提示联合用药抑制了JAK2/STAT5 信号通路，可能是其抑制Bcr-Abl 及其磷酸化水平的作用机制。此外，IM 和SAHA 联合也显著下调抗凋亡蛋白Mcl-1。Inoue 等［16］报道下调Mcl-1 能增强HDAC 抑制剂介导的髓系白血病细胞凋亡。最近研究证明，Mcl-1 是Bcr-Abl的靶基因，抑制Bcr-Abl 能下调Mcl-1［17］。本研究结果显示，联合用药时Bcr-Abl 及其磷酸化水平明显下调，Mcl-1 的表达也明显抑制，细胞凋亡增加，这也证明Mcl-1 是Bcr-Abl 的靶基因;其下调导致K562 细胞凋亡增加。

综上所述，本实验证明IM 和SAHA 单独应用以剂量依赖性方式抑制K562 细胞株生长，两药联合使用在体外低剂量时能显著协同杀伤K562 细胞，使细胞凋亡增加;联合用药能协同抑制Bcr-Abl 及其磷酸化水平，抑制JAK2/STAT5信号途径，下调下游靶基因Mcl-1。本研究结果提示IM 联合SAHA 可能是逆转耐药，对IM 反应不佳的患者具有潜在的临床应用价值。

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