变应性鼻炎基因治疗研究与展望

章如新

·变态反应性疾病·

变应性鼻炎基因治疗研究与展望

章如新

变应性鼻炎(allergic rhinitis, AR) 是一种多基因遗传和环境因素共同影响的鼻变态反应性疾病。流行病学及遗传学证据表明，该病具有多基因调控的特征, 某些相关基因在其发病中发挥重要作用。随着基因组学研究的进展及AR相关基因的不断深入研究，AR的基因治疗研究已成为学科的前沿领域。

1 基因治疗基本原理

基因治疗(gene therapy)是指利用分子生物学方法将目的基因导入靶细胞，使之表达目的基因产物，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，从而使疾病得到治疗。从广义上而言，基因治疗包括从DNA水平所采取的治疗措施和技术。基因治疗的研究随着科学技术的不断进步和科研相关问题的逐步解决，而不断深入发展和延伸。基因治疗的基本原理有基因置换、基因修正、基因修饰、基因失活及免疫调节等。

1)基因置换。就是用正常的基因原位替换病变细胞内的致病基因，使细胞内的DNA完全恢复正常状态。这种治疗方法最为理想，但目前由于技术原因尚难以直接用于临床，多数是用于动物胚胎实验研究。

2)基因修正。是指将缺陷基因的突变碱基序列纠正，而正常序列予以保留。这种基因治疗方式最后也能使缺陷基因得到完全恢复，操作上要求高，技术难度大。

3)基因修饰。又称基因增补或基因补充，即将目的基因导入缺陷细胞或其他细胞，使目的基因的表达产物能够修饰缺陷细胞的功能或使原有的某些功能得到恢复或加强。在这种治疗方法中，缺陷基因仍然存在于细胞内。目前基因治疗大多采用这种方式。

4)基因失活。即利用核酶等反义技术及其RNAi技术能够特异性地封闭、阻断基因异常表达，抑制一些有害基因的表达，以达到治疗疾病的目的。

5)免疫调节。将抗体、抗原或细胞因子基因导入机体，调节机体的免疫状态，达到预防和治疗疾病的目的。

2 AR基因治疗的策略

2.1 利用芯片技术筛选发现AR相关基因 AR是一种多基因调控的变应性疾病。遗传学研究已发现，在染色体11q13、12q、10q11.2、1q42-43、6p22-24等存在AR相关基因[1]。基因功能涉及组织相容性抗原复合体，细胞因子白细胞介素4(interleukin 4, IL-4)，IL-13及受体等，趋化因子 RANTES、MCP-1、EOTAXIN及受体等,免疫球蛋白E(immunoglobulin E, IgE)等[2]。由于涉及不同种族人群，相关基因存在一定的差异性，如HLA-DRB1、DQA1、DQB1在AR中，等位基因位点存在相关性及多态性[3]。随着人类基因组计划的进展，人类已进入了这种大规模、大通量的基因研究时代。一些传统的血清学诊断技术和分子生物学检测技术，如以抗体为基础的一些常规诊断技术方法和聚合酶链反应诊断技术虽然有一定的实用性和优越性，但在大规模的遗传病研究中，其实际应用还存在一定的局限性；而基因芯片由于其巨大的分析能力，极少的样品用量，简单、快速、高效的使用方式，能够对个体生物信息进行高速采集和分析，在遗传基因的研究中越来越受到重视。基因芯片技术也已应用于AR的研究中，利用基因表达谱芯片筛选差异表达基因，为进一步研究AR的诊断与治疗提供基因水平的线索。我们利用基因表达谱芯片筛选了AR相关基因，研究发现国人AR患者中AR相关基因有趋化因子CCL-1、CCL-2、CCL-8、CCL-18、RANTES、eotaxin、血小板因子4(platelet factor-4，CXCL4) 基因等及趋化因子受体CCR2、CCR3、CCR4、CCR8、CX3CR1、XCR1等[4]。随后，国外也利用表达谱芯片筛选出AR相关基因细胞因子有IL-4、IL-13及受体等，趋化因子CCL-2、CCL-3、CCL-8、 RANTES、eotaxin及CCR3、CCR4、MCP-1等，与我们的研究结果基本相一致[5]。

2.2 AR的基因调控网络研究 遗传学研究的不仅是相关基因，而且包括基因之间的调控关系。近年来，研究发现，微小RNA(micro RNA,miRNA)在基因表达中充当调控者的角色，在细胞分化凋亡、生物发育、疾病发生等方面均起重要作用[6]。miRNA是长约22个核苷酸的非编码单链RNA分子，本身不具有开放阅读框架，不编码任何蛋白质，但广泛存在于植物、线虫甚至人类的细胞中,在生命活动中发挥重要调控作用[7]。它能在RNA代谢的多个层面对与其同源的底物进行调控，通过形成RNA诱导沉默复合体(RNA induced silencing complex,RISC)与靶基因3′端非翻译区不完全互补结合，诱导mRNA的切割降解、翻译抑制或者其他形式的调节机制，从而抑制靶基因的表达[8]。目前为止，人类基因组内已发现的miRNA已有3 000个，它们调控约50%以上基因的表达，因此筛选疾病相关的miRNA分子及分析其调控网络也成为遗传学中的研究热点和前沿。

我们利用miRNA芯片技术初步筛选了AR相关miRNAs，研究结果提示，hsa-miR-874、hsa-miR-143、hsa-miR-498、hsa-miR-187等在AR中存在差异表达。这些研究表明，差异表达的miRNA在AR基因调控中的作用[9]。近年，有研究者对新生儿脐带血免疫球蛋白E及157种miRNA进行测定，发现在miRNA-21减少的新生儿中，其免疫球蛋白E明显升高，且单核细胞表面TGFBR2分子表达升高，这一现象与儿童的AR相一致。这表明，某些miRNA可以作为疾病的预报器[10]。miRNA的作用方式是通过对转录后基因表达的调控，来实现生物学效应的。一条miRNA可能控制着成百上千基因的转录，因此miRNA很可能与疾病的发病相关。阻断其表达，也许可以治疗某些相关疾病。近些年发现的miRNA类似物的合成物又称Antagomirs，可以阻断miRNA靶基因，诱导miRNA靶基因的长时间基因沉默[6]。Mattesa等[11]对过敏体质BALB/c小鼠鼻内应用miRNA-126 Antagomirs，室内尘螨诱发小鼠呼吸道过敏反应，发现小鼠的Th2细胞相关反应减弱，气道高反应性降低，嗜酸性粒细胞聚集减少，炎症得到一定控制,这也进一步说明miRNA在疾病中的重要作用，及其基因类似物的治疗前景。

2.3 基因调控的RNA干扰研究 RNA干扰研究是基因干预研究的重要实验手段，其中包括miRNA干扰与小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)。miRNA干扰通过将过表达miRNA载体转染细胞或生物体内，引起目的miRNA大量过表达，导致一系列下游相关基因的表达发生改变。siRNA技术则因其对目的基因的特异性和高效性，可以使目的基因表达的抑制率达到90%，从而在疾病的发病机制中发挥重要作用[12]。Hosoya等[13]发现，STAT6 siRNA可以显著抑制IL-4/TNF-α诱导的真皮成纤维细胞合成分泌eotaxin，从而抑制AR炎性因子的浸润。因此，利用RNA干扰技术研究AR基因调控机制，是目前广泛开展的课题。

2.4 调控Th1/Th2细胞平衡 Th2相关细胞因子和炎性介质在AR中发挥重要作用，因此，通过基因水平抑制Th2细胞功能，减少相应细胞因子和炎性介质的释放，是治疗AR的希望所在。如转录因子GATA3的反义寡链核苷酸，可以减少小鼠体内Th2型细胞因子的产生，降低气道高反应性，减少嗜酸性粒细胞的浸润[12]。IL-5的干扰siRNA，可以显著降低气道高反应性，降低支气管灌洗液中extonin水平，以及肺组织中IL-5的水平[14]。同时，加大Th1型相关细胞因子的表达也是改变Th细胞平衡的方法之一，如卵清蛋白致敏小鼠内转染重组基因，可以抑制Th2型细胞免疫反应，Th2相关细胞因子IL-4、IL-5、血清特定IgE水平、嗜酸性粒细胞肺含量均显著降低，气道高反应性得以抑制[15-16]。

3 AR基因治疗研究现状

传统AR治疗药物,如抗组胺药、糖皮质激素等仍是目前治疗AR的主要方法，但仅能缓解部分症状，没有从根本上解决AR的治疗问题。因此，寻找新的治疗方法，已成为科学工作者思考和努力的方向。近年来所开展的AR遗传学研究表明，其发病与多种基因的异常表达有密切关系。利用基因芯片技术对AR患者基因表达谱进行研究，发现存在较多差异表达基因，其中有参与炎性反应、免疫应答、免疫调控等的相关基因[17]。Liu等[18]对AR患者外周血单核细胞进行基因表达谱的检测，结果也进一步证实AR为多基因疾病。随后又发现重组激活基因，多种趋化因子CCL8、CCR3、CCR4等基因在AR中高表达。这些高表达的细胞因子在Th2型细胞免疫反应、炎性细胞的趋化募集及脱颗粒中起着重要作用[19-20]。

作为一类多基因遗传病，寻找AR关键致病基因并进行基因干预治疗是AR治疗的重要研究方向之一。目前国内外已有不少AR相关基因的研究，同时也开展了一些基因干预性治疗研究。He等[21]将肿瘤坏死因子α融合基因的质粒注入AR小鼠的鼻黏膜细胞，可以减少嗜酸性粒细胞等炎性细胞。利用小干扰RNA技术干预P物质及其受体(NK1R)的基因表达是治疗AR的一个新方向。我们用自行设计构建合成的SP-siRNA及NK1R-siRNA在AR动物模型中，通过鼻腔局部干预处理，研究发现SP-siRNA及NK1R-siRNA有效地抑制了鼻黏膜嗜酸性粒细胞的浸润及多种炎性细胞因子的表达，抑制抗原诱导的肥大细胞脱颗粒及FcεRI介导的信号转导，从而减轻鼻黏膜局部炎症[22-23]。这些研究为AR的基因治疗提供了新的思路。

4 AR治疗展望

目前认为，AR的发病有多种相关基因参与，并存在基因调控机制。也许存在尚未被发现的某些AR特定关键基因，这些特定基因可能在某种内外环境的刺激下被激活或表达。基因的遗传易感性、基因与内外环境因素的相互作用等尚有待进一步研究。AR基因治疗的实验研究才刚刚开始，尚需我们不断探索和认识，而寻找AR的致病基因及基因调控机制的研究是AR基因治疗研究的基本思路和方向。

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2012-10-15)

(本文编辑 杨美琴)

复旦大学附属华东医院耳鼻咽喉头颈外科 上海 200040

章如新(Email：zhangruxin@hotmail.com)