半闭弯尾姬蜂寄生对小菜蛾幼虫解毒酶系的影响

黄 芳，章金明，郦卫弟，吕要斌

(浙江省农业科学院植物保护和微生物研究所，浙江 杭州 310021)

小菜蛾Plutella xylostella L.属鳞翅目Lepidoptera菜蛾科Plutellidae，最早发源于地中海地区，危害含有芥子油及其葡糖苷的十字花科植物，寄主多达40种以上，是十字花科蔬菜的主要害虫之一。Waterhouse［1］将其定义为太平洋地区十字花科蔬菜中为害等级最高的害虫。近年来小菜蛾发生范围越来越大，频率越来越高。小菜蛾环境适应能力很强，对众多化学农药产生了很高的抗性［2］。研究认为，一些解毒酶，如谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、多功能氧化酶 (MFOs)、羧酸酯酶 (CE)和乙酰胆碱酯酶 (AchE)等，其活性的改变可反应昆虫体内对诸多化学药剂的变化［3］。

生物因子在控制小菜蛾种群数量方面起着十分重要的作用，小菜蛾在生长发育的各阶段均会遭到寄生性及捕食性天敌的袭击。经过长期室内及田间实验总结证明，半闭弯尾姬蜂 Diadegma semiclausum在控制小菜蛾种群方面具有十分重要的地位［4］。早在1938年，半闭弯尾姬蜂就已经作为从境外引入的天敌用于控制当地小菜蛾，引入后其控害作用一直十分有效，并且在其他国家也进行了成功应用，如澳大利亚、印度尼西亚、中国台湾等，现如今已成为小菜蛾综合防治管理中的一个重要环节［5］。

随着人们环保意识的增强，田间生物防治在整个综合防治体系中所占比例越来越大，但化学药剂仍然有其存在的必要性和不可替代性。目前，针对昆虫—化学药剂—天敌这一体系已经开展了大量的工作，其中大部分报道集中于天敌捕食或寄生经施药处理的昆虫后的死亡率及相关的生理生化变化［6］。然而，针对被天敌寄生后的寄主的抗药性却鲜有报道。

因此，为了更加科学地指导田间合理用药，本文通过以小菜蛾—半闭弯尾姬蜂系统为研究对象，检测半闭弯尾姬蜂寄生后不同龄期寄主小菜蛾幼虫体内解毒酶系的活性变化，明确寄生对小菜蛾幼虫抗药性的影响，以期为小菜蛾的综合生物化学防治提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 昆虫饲养

小菜蛾在控光 (L14:D10，光照强度＞1 000 lx)、控温 (22±1)℃、控湿 (相对湿度60% ～80%)的养虫室或智能人工气候箱内饲养。将一养虫笼固定为产卵笼，收集小菜蛾蛹于此笼内，待羽化后供给成蛾20%的蜂蜜水和清水;把一片甘蓝叶套在扎有许多针孔的保鲜袋内，插入一盛满水的细口瓶中，放入产卵笼中;待小菜蛾产卵于保鲜袋上后，取下保鲜袋置于4℃冰箱短期保存备用或直接移接到盆栽的甘蓝上饲养，取适龄幼虫用于实验。

将网扫的成蜂、蜂茧和寄生的小菜蛾幼虫从野外采回作为蜂源，在控光、控温、控湿的人工气候室内进行繁殖及续代:将带有约300多头2龄末至3龄初的小菜蛾幼虫的盆栽甘蓝置于养虫笼内，吸取保蜂盒中已羽化2 d的健壮雌雄蜂各20头，放入养虫笼内，供给10%的蜂蜜水，任其自由交配并产卵寄生72 h后，移走成蜂，继续饲养小菜蛾幼虫，并陆续挑出未寄生已化蛹的小菜蛾蛹防止化蛾产卵(寄生的小菜蛾比未寄生的发育时间长)，直至幼蜂结茧，收集蜂茧于保蜂盒中待其羽化。

1.2 供试昆虫的选取

小菜蛾2龄幼虫大小及生理状态具有高度的一致性，因此为保证实验中处理与对照的可比性，供实验用虫均采用刚进入3龄的幼虫，即先挑取2龄末幼虫，待其蜕皮后用于寄生。

为确保单次成功寄生，寄生方法如下:在1支长8 cm、直径1.5 cm的小试管内引入羽化2 d已交配过的雌蜂1头，然后用毛笔挑取小菜蛾幼虫1头放入管内观察，产卵行为发生1次后用毛笔移出幼虫，换另1头未寄生的幼虫重复操作，控制每头雌蜂寄生30头左右。将寄生过的小菜蛾幼虫接到事先准备好的叶片或盆菜上饲养，用于实验。

1.3 谷胱甘肽-S-转移酶 (GST)活性测定

GST酶活性测定参照 Chiang等［7］的方法:将10头小菜蛾幼虫放入 900μL含有 1 mmol·L-1PTU的磷酸缓冲液 (pH为6.8)中，在液氮中研磨后，4℃条件下3 000 g离心5 min后弃沉淀，将上清液在4℃条件下再8 500 g离心1 h，上清液即为待测酶液，直接测定或放置于-80℃保存。取待测酶液加入到反应液中 (含0.8 mmol·L-1二硝基苯和0.8 mmol·L-1谷胱甘肽)，测定 D340值。

1.4 多功能氧化酶 (MFOs)活性测定

酶液制备:取3头小菜蛾幼虫在冰冷的PBS中漂洗后，加入300μL冰冷反应缓冲液 (PBS:0.1 mol·L-1，pH 值 7.4，含 1 mmol·L-1苯基硫脲，1 mmol·L-1EDTA，1 mmol·L-1苯基磺酰氟，0.1 mmol·L-1二硫苏糖醇，10%甘油)于冰上匀浆，匀浆液于4℃条件下10 000 g离心15 min，上清即为粗酶液，直接测定或于-80℃保存。

参照Sang等［8］的方法略加以修改，以对硝基酚作标准曲线，测定多功能氧化物酶活力:取100μL粗提酶液，加入1μL的0.1 mol·L-1对硝基苯甲醚(4-Nitroanisole) (用丙酮配制)，于37℃下保温5 min后，加入20μL的2.0 mmol·L-1还原型辅酶II(NADPH)，于37℃恒温振摇10 min后，加入1 mol·L-1的盐酸50μL终止反应;加500μL氯仿萃取，取 300μL氯仿层与 300μL NaOH溶液(0.5 mol·L-1)混合后，于20 min内取NaOH层测定D405值的变化，用对硝基酚的生成量表示酶活力［μmol·L-1·mg-1· (10 min)-1］;用 20 μL PBS代替NADPH作为对照。

1.5 羧酸酯酶 (CE)活性测定

CE酶活性测定的方法参照 Asperen［9］的方法:将1头小菜蛾幼虫放入200μL Pipes-NaOH缓冲液(0.1 mol·L-1，pH值7.4)中研磨，4℃条件下15 000 g离心5 min，上清液作为待测酶液，直接测定或放置于-80℃保存;取20μL待测酶液加入到反应液中 (含 0.3 mmol·L-1α-醋酸萘酯)(总体积300μL)，室温孵育15 min后加入50μL染剂 (1%固蓝盐B和5%十二烷基硫酸钠以体积比5∶2混合)测定 D595值。

1.6 乙酰胆碱酯酶 (AchE)活性测定

在冰冷的0.1 mol·L-1PBS中解剖获得10头小菜蛾幼虫的大脑，清洗后置于50μL 0.1 mol·L-1MOPS缓冲液中冰浴匀浆;4℃条件下15 000 g离心匀浆液15 min，上清液即为待测酶液，直接测定或-80℃保存。

在MOPS缓冲液中分别加入碘化硫代乙酰胆碱、5-5’-二硫代双-2-硝基苯甲酸和碳酸氢钠使终浓度分别达到0.6，9.6和42 mmol·L-1，形成反应液;取280μL反应液25℃条件下温育5 min，加入待测酶液20μL后再静置30 min后测定D402值。用MOPS缓冲液代替酶液作为对照。

2 结果和分析

2.1 寄生对寄主GST活性的影响

如图1所示，相对于未寄生的小菜蛾幼虫，寄生后的小菜蛾幼虫体内GST活性显著提高，且随着寄生时间的延长这种差异逐渐加大，说明半闭弯尾姬蜂寄生能够显著影响寄主小菜蛾幼虫的GST活性。

2.2 寄生对寄主CE活性的影响

如图2所示，不论CE酶活性还是酶活力的变化趋势，被寄生的小菜蛾与未被寄生的小菜蛾之间都不存在显著差异。

2.3 寄生对寄主MFOs活性的影响

如图3所示，除了3龄末幼虫外，未被寄生的小菜蛾幼虫MFOs活性与被半闭弯尾姬蜂寄生后的小菜蛾幼虫的MFOs活性不存在显著差异。而寄生后3龄末幼虫的MFOs活性得到显著提高。

图1 半闭弯尾姬蜂寄生对寄主小菜蛾体内GST活性的影响

图2 半闭弯尾姬蜂寄生对寄主小菜蛾体内CE活性的影响

图3 半闭弯尾姬蜂寄生对寄主小菜蛾体内MFOs活性的影响

2.4 寄生对寄主AchE活性的影响

如图4所示，寄生后的小菜蛾幼虫AchE活力较对照发生显著变化。在整个发育过程中，半闭弯尾姬蜂寄生后小菜蛾幼虫体内的AchE活力变化并不显著，然而相对于未寄生小菜蛾体内AchE活性变化而言，被半闭弯尾姬蜂寄生后的小菜蛾体内AchE的活性是受到抑制的。

图4 半闭弯尾姬蜂寄生对寄主小菜蛾体内AchE活性的影响

3 小结和讨论

寄生蜂幼蜂能够通过调节寄主代谢间接影响寄主对一些异源物譬如杀虫剂等的抗性。Idris等［10］发现小菜蛾在被岛弯尾姬蜂Diadegma insulare寄生后48 h后对杀虫剂的敏感性相对于对照下降。Ibrahim等［11］也发现寄生后的寄主幼虫体内的解毒酶系活性明显高于未被寄生的幼虫。在本文研究结果中，半闭弯尾姬蜂寄生后的寄主GST活力显著提高，部分寄主的MFOs活力提高，这一部分的结果与以上研究结果相一致。唐振华等［12］证明 GST活性提高是小菜蛾抗性提高的一个重要机制。Takeda等［13］研究表明，菜蛾盘绒茧蜂寄生后小菜蛾幼虫的相关解毒酶 (其中包括GST)活力得到显著提高，这一事实进一步证实了 Liu等［14］提出的菜蛾盘绒茧蜂的寄生能够增强其寄主小菜蛾幼虫对杀虫剂抗性的观点。因此，半闭弯尾姬蜂作为小菜蛾重要的幼虫寄生蜂，其寄生后寄主的抗性同样得到提高。Shelby等［15］证实索诺齿唇姬蜂的主要寄生因子之一——多分DNA病毒 (PDVs)能够提高烟芽夜蛾幼虫体内GST的表达水平;此后，Kroemer等［16］也做出了相同的结论。半闭弯尾姬蜂的主要寄生因子中也含有PDVs［17］。由此推断，半闭弯尾姬蜂寄生后寄主幼虫GST活性的提高与抗性的增强可能与PDVs有关。

在Takeda等［13］的研究结果中，菜蛾盘绒茧蜂寄生后的寄主小菜蛾幼虫的AchE的活力也显著提高;但本文的研究结果恰恰与之相反。AchE是有机磷类和氨基甲酸酯类杀虫剂最重要的靶标物质［18］。有机磷类和氨基甲酸酯类等杀虫剂主要通过抑制中枢神经系统中AchE对神经递质乙酰胆碱Ach的水解作用，干扰和最终阻断突触传导而发挥它们的毒效。在乙酰胆碱酯酶所介导的抗性机理研究中，AchE活性增加、AchE量的增加都可能与昆虫抗性水平成正比［19］。菜蛾盘绒茧蜂寄生后寄主幼虫体内的AchE显著提高，说明寄生后寄主幼虫对有机磷和氨基甲酸酯杀虫剂的抗性也相应提高［13］;据此，半闭弯尾姬蜂寄生后寄主幼虫AchE活力显著下降，可能意味着寄生后寄主幼虫对有机磷和氨基甲酸酯杀虫剂的抗性降低。这一现象与其他寄主—寄生蜂系统的研究结果存在差异，其原因还有待于进一步研究。

半闭弯尾姬蜂寄生对寄主小菜蛾幼虫的免疫系统有显著的抑制作用［20］，然而半闭弯尾姬蜂作为一种容性的内寄生蜂，在一段相当长的时间内会和寄主保持一种共生关系。通过本文实验证明，被半闭弯尾姬蜂寄生后寄主幼虫的部分抗药性得到增强，可以被认为是对寄主被削弱的免疫系统的一种补偿。总得来说，在野外天敌种群数量较大的情况下，如果不恰当地使用化学杀虫剂，不仅仅会影响天敌的田间种群，可能还会降低化学药剂的控害效果。

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