双绿5号蚕豆根瘤菌的分离及其包衣处理的效果

陈小央

(勿忘农集团有限公司，浙江 杭州 310020)

研究结果表明，接种根瘤菌可以显著地提高蚕豆的产量，增加土壤肥力［1-5］。因此，对浙江省主栽的蚕豆新品种双绿5号［6］进行根瘤菌有效共生匹配筛选，开展蚕豆种子包衣技术试验，对包衣效果进行初步比较，以期为蚕豆种子包衣商品化提供技术支持，进而提高蚕豆种子质量，加快双绿5号种子的推广应用。

1 材料与方法

1.1 材料

双绿5号蚕豆种子由本公司生产。

根瘤菌培养基 (YMA):甘露醇10 g，酵母粉1 g，土壤浸出液200 mL，调整pH值为7.2，加入琼脂粉 20 g，补足水至 1 000 mL。121℃下灭菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 蚕豆根瘤菌的分离与纯化

菌种来源取自于双绿5号蚕豆高产区萧山农业对外综合开发区17工段农场，选择健壮株开花后结荚前拔取5株，检查根瘤菌，挑选色鲜饱满的根瘤进行分离。先用无菌水清理根瘤表面污泥，接着在75%酒精中清洗浸泡1 min，然后用升汞消毒根瘤表面，最后分别用75%酒精和无菌水清洗2遍，压碎根瘤，用接种针蘸取瘤液在YMA平板上进行划线分离，30℃培养2 d。挑取无色半透明粘稠的单菌落进行纯化，纯化方法见文献［1，7］。

1.2.2 蚕豆根瘤菌回接菌株培养

将供试菌株先接到YMA斜面活化，然后转接于装有YMA液体培养基的三角烧瓶，30℃过夜培养至对数期，用平板法检测含菌量为1亿·mL-1。

灭菌处理。将试验所需用的镊子、培养皿、滤纸、玻璃棒包好，在121℃下灭菌30 min。分别称取75 g蛭石装入塞有纱布条的塑料杯中，在下层的玻璃瓶中注入50 mL蒸馏水，将装有蛭石的塑料杯置于玻璃瓶上，再用牛皮纸包扎好，将其放入高压锅中间歇灭菌3 h，温度为121℃ 。

蛭石栽培及接种。双层钵法:将4粒正常萌发一致，根长1 cm左右的蚕豆种子置于发酵好的根瘤菌液中，浸泡15 min(以淹没种子为宜)，用无菌镊子夹取其植入装有无菌蛭石的塑料杯中，每杯种植1粒，再沿各种子根部加入该菌液2 mL。在底层的供水瓶中装入低氮营养液 (液面不能高于上层钵底部)，用牛皮纸封口 (所用材料均提前灭菌)，同时在牛皮纸中间剪一小洞 (直径约1 cm)。同时设不浸泡接种根瘤菌的为对照，以上步骤均在超净台上进行，然后转入光照强度为6 000～10 000 lx，昼夜温度为 (25±5)℃，日照时数14 h的日光室中培养。待蚕豆生长35 d后收取。收取时用水冲洗净根，分别测定每株蚕豆的有效根瘤数 (以呈现粉红色为标准)、鲜瘤重、植株地上部干物重。

1.2.3 根瘤菌种衣剂不同药种比较

将发酵液为主要成分，按照重量百分比与成膜剂配制成根瘤菌种衣剂，每处理称取双绿5号蚕豆种子 2 kg，按药种比 1∶20，1∶35，1∶50 和 1∶70 分别折算种衣剂药液重量，置于密封容器内摇匀后，在通风良好的室内自然晾干，温度为 (27±2)℃，相对湿度约70%，观察种子包裹效果，从每个处理的种子中随机取出200粒，用目测法观察包衣完整度。4～14 d测定发芽势和发芽率，测定方法GB/T 3543.4—1995纸间法进行，4次重复，每处理100粒，结果进行生物统计。余下的种子播种进行田间试验，随机区组排列，小区面积3.33 m2，4次重复，四周设保护行，株距25 cm，行距100 cm，每穴播1粒。播后30 d，检查成苗率，开花时检查根瘤数，收获后考查产量。

1.2.4 根瘤菌种衣剂包衣种子贮藏比较

6月收获双绿5号蚕豆种子，将种子按药种比1∶35包衣好，自然晾干到水分符合国标 GB 4401.2—1996，用未包衣种子作对照。采用塑料袋密封包装，在种子仓库常温下保存，分别于密封后15，30，60，90和120 d测定其发芽率，观察种子发芽力情况。

2 结果与分析

2.1 蚕豆根瘤菌的分离与纯化

从蚕豆新鲜株根系上分离到根瘤菌纯化株1株R，在YMA平板上为无色半透明粘稠的圆形单菌落，隆起，表面光滑，有荚膜。

2.2 根瘤菌回接效果

将菌株R用双层钵培养法培养，结果结瘤数(平均每株62.5个)显著高于不接菌对照，鲜瘤重也明显高于对照，证明分离的菌株R能有效侵染双绿5号蚕豆根系，而且对蚕豆地上部分干物质积累的增加有显著作用，与不接种的对照相比对茎叶干物质积累增加97.5%(表1)。

表1 根瘤菌回接处理的效果

2.3 根瘤菌种衣剂不同药种比包衣种子效果

由表2可知，不同包衣药种比对蚕豆种子的包衣处理效果差异明显，除 1∶70外，1∶20，1∶35，1∶50包衣完整度81% ～90%。发芽率与发芽势除了1∶20低于对照外，其余药种比均高对照或相等。

表2 种衣剂不同药种比处理的发芽情况

从表3结果可看出，在1∶20的药种比时成苗率受到较大影响，根瘤数随着药种比的减少而减少，但均远远高于不包衣对照。包衣的处理有效分枝数、单株结荚数和鲜荚产量均高出不包衣对照，但鲜荚产量以药种比1∶35的最高，显著高于不包衣对照。

表3 根瘤菌种衣剂不同药种比处理的效果

2.4 根瘤菌种衣剂包衣种子贮藏效果

从表4结果说明，用根瘤菌包衣双绿5号种子进行一个常温贮藏周期 (从收获到播种)120 d，对发芽力没有劣变的影响。

表4 根瘤菌种衣剂包衣种子不同贮存时间对发芽率的影响

3 小结与讨论

根瘤菌对于蚕豆生产具有显著的增产作用，可大大减少田间化肥用量，省工省本，对提高产品品质，降低环境污染具有重要意义。本试验中纯化的R菌株分离自双绿5号蚕豆生长株根系根瘤，与双绿5号蚕豆有很好的共生匹配性，可以作为生产上推广应用的菌株。

双绿5号蚕豆为大粒型圆扁形蚕豆，包衣时种子转动速度慢，难度较大。为了达到包衣效果与成本兼顾的目的，种子包衣的药种比以1∶35较为合适，若减少药种比，提高包衣浓度，虽然能提高包衣均匀度和完整度，但会明显增加包衣厚度，成本增加，又影响出苗，主要表现为根的正常生长受到抑制;而增加药种比，降低包衣浓度，则使包衣不完整均匀，又影响菌肥效果。

根瘤菌包衣种子贮藏试验结果表明，从当年6月蚕豆种子收获，到9-10月播种，按1∶35的药种比包衣处理，对发芽和田间成苗没有明显影响。但要注意包衣后种子包装贮藏前水分必须在GB 4401.2—1996规定的范围内，即≤12%，否则会对发芽成苗产生不良影响。

［1］ 奥巴托.共生固氮技术手册 ［M］.蒋有绎，周枫，译.北京:科学出版社，1987:109-113.

［2］ 王清湖，敬岩，张惠，等.提高蚕豆共生固氮效应的研究［J］. 土壤，1997(6):307-310.

［3］ 缪礼鸿，周俊初.根瘤菌竞争性研究进展 ［J］.华中农业大学学报，2003，22(1):84-89.

［4］ 王文丽，李娟，卢秉林.蚕豆根瘤菌的分离、筛选及其肥效研究 ［J］.干旱地区农业研究，2010，28(6):112-115.

［5］ 李爱萍，赖永红，廖海林，等.蚕豆种子包衣技术及其应用效果 ［J］.福建农业科技，2002(5):28-29.

［6］ 张真，张彭达，应必鹏，等.蚕豆双绿5号的种植表现及栽培技术 ［J］.浙江农业科学，2010(5):944-945.

［7］ 黄新，王亚琴，刘建新，等.接种根瘤菌对不同紫花苜蓿品种结瘤和生物学产量的影响 ［J］.浙江农业学报，2005，17(6):391-394.