E-cadherin蛋白表达与非小细胞肺癌患者临床病理特征及预后的联系

闵凌峰 徐兴祥 陈 勇 杨俊俊黄 谦 贾冬云 宋 勇

E-cadherin蛋白是一种钙依赖性的黏附分子，主要介导上皮细胞间的黏附和维持组织结构的完整性，在维持细胞形态、迁移及黏附功能上具有重要作用［1］。E-cadherin蛋白常在多种肿瘤中失活，其表达减弱或缺失可促进肿瘤细胞的转移［2-3］。吸烟是影响肺癌患者存活率的独立有害因素，其负面影响是独立于吸烟相关并发症的［4］。吸烟对NSCLC患者不良预后的影响，可能是通过与调节肺癌细胞的生物学行为相关，如转移能力等［5］。因此，本研究通过回顾性分析探讨E-cadherin蛋白与非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)患者临床病理特征及预后的关系，侧重探讨吸烟严重程度对E-cadherin蛋白表达的影响，为抑制肺癌转移研究提供新的实验基础和理论依据。

材料和方法

一、研究对象

112例具有随访资料的原发性肺鳞癌、腺癌组织标本来自2003年10月到2005年10月未经放疗和化疗的初诊患者，并经病理诊断确诊。其中男90例，女22例，平均年龄为58岁。按2004年WHO肺肿瘤组织学分类标准，其中鳞癌70例，腺癌42例。高分化7例，高中分化15例，中分化47例，中低分化23例，低分化20例。患者的吸烟严重程度-吸烟年包(吸烟年包=每日吸烟包数×吸烟年)分为0、戒烟组、1－19、20－39、40－59、＞60六组。依据国际抗癌联盟(UICC)1999年修订的肺癌p-TNM分期标准，Ⅰ期9例，Ⅱ期20例，Ⅲ期75例，Ⅳ期8例。患者生存期的计算是从初诊日期到随访日期，或由于复发、转移而死亡的日期为止。

二、主要试剂

E-cadherin鼠抗人单克隆抗体购于Santa cruz公司，免疫组织化学超敏S-P试剂盒及DAB辣根过氧化酶酶底物显色剂购于福州迈新生物技术开发公司。

三、免疫组化染色

以3μm厚度连续切片，经松节油脱蜡，梯度乙醇脱水，PBS冲洗三次后，按试剂盒说明进行RKIP染色。DAB染色，苏木素复染，梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。

四、结果判定标准

E-cadherin阳性染色定位于细胞膜。光镜高倍镜下，随机选择5个视野，分别计算200个细胞，共计算1000个细胞，采用双评分法，参照Consantine等的标准，高倍镜(×400)下综合染色强度和阳性细胞所占比例进行半定量测定。染色强度评分标准:不着色0分;黄色1分;棕黄色2分;黄褐色3分。阳性细胞所占比例评分标准:阳性细胞数＜10% 者0分;10% ～40% 者1分;40% ～70% 者2分;≥70% 者3分。两种评分相加，0～1分为(－);2分为(+);3～4分为(++);5～6分为(+++)［6］。

五、统计学分析

应用SPSS18．0统计软件对实验结果进行统计学分析，组间多重比较采用Kruskal-Wallis test，两两比较用Mann Whitney U test，P＜0．05即差异有统计学意义。应用Kaplan-Meier法进行单因素生存分析，应用Cox比例风险模型进行多因素分析，P＜0．05即差异有统计学意义。

结 果

一、NSCLC临床病理特征与吸烟状况的关系

吸烟状况与患者的肺癌病理类型(腺癌或鳞癌)、肿瘤原发灶状况(T-status)、远处转移状况(M-status)、TNM分期等均无明显关系(P＞0．05)，差异无统计学意义。但吸烟的状况与患者的性别(P＜0．01)、年龄(P＜0．05)、区域淋巴结转移状况(N-status)(P＜0．05)、肿瘤分化程度(P＜0．05)明显相关，差异有统计学意义，见表1。

表1 112例NSCLC患者临床病理特征与吸烟状况关系Table 1 Relationship between clinicopathologic features and smoking status of 112 NSCLC patients

二、免疫组织化学检测E-cadherin在NSCLC中的表达

采用免疫组织化学检测E-cadherin蛋白在42例腺癌、70例鳞癌组织中的表达水平。结果显示E-cadherin蛋白主要定位在细胞膜，在腺癌及鳞癌组织中均有表达，但吸烟者肺腺癌及鳞癌组织中表达较不吸烟者明显下降(图1)。统计学分析(Kruskal-Wallis秩和检验)显示E-cadherin表达与性别、年龄、肺癌病理类型、肿瘤原发灶状况(T-status)、远处转移状况(M-status)及肿瘤分化程度等均无明显关系(P＞0．05)，但与患者的区域淋巴结转移状况(N-status)、TNM分期及吸烟状况明显相关(P＜0．05)，见表2。

表2 E-cadherin蛋白表达与NSCLC临床病理特征的关系Table 2 Relationship between expression of E-cadherin protein and clinicopathologic features of NSCLC patients

图1 免疫组织化学检测E-cadherin在NSCLC组织中的表达A:非吸烟肺腺癌;B:吸烟肺腺癌;C:非吸烟肺鳞癌;D:吸烟肺鳞癌

三、多变量分析有意义的预后因子及生存曲线分析

多变量分析结果显示:肿瘤原发灶状况(T-status)、远处转移状况(M-status)、TNM分期、肿瘤分化程度、吸烟严重程度、E-cadherin的表达是独立的 NSCLC预后因子(P＜0．05)，见表3。Kaplan-Meie生存曲线分析结果显示:E-cadherin表达下调的患者，其生存率明显下降(P＜0．05，图2)。

表3 多变量分析有意义的预后因子Table 3 Significant prognostic factor of multivariated analysis

图2 Kaplan-Meier生存曲线

讨 论

钙黏蛋白(cadherin)是一组 Ca2+依赖性跨膜糖蛋白，主要有E、P、N三种亚型，目前认为E-cadherin与肿瘤浸润和转移的关系较密切［7］。E-cadherin是维持上皮细胞形态及同种细胞间黏附连接的重要黏附分子。相关研究已证实E-cadherin基因是一个重要的肿瘤转移抑制基因，它可能通过促进同型细胞之间的黏附，使癌细胞之间保持密切接触，减少癌细胞脱离原发灶向远处转移［8］。如果E-cadherin表达下降，肿瘤细胞连接松散，也可使肿瘤细胞分裂增殖失控，易脱离原发灶而发生局部或远处转移［9］。

E-cadherin与肺癌关系的众多研究发现，肺癌细胞E-cadherin表达缺失或降低以及功能缺陷与肺癌的侵袭和转移可能存在相关性［10］。本研究结果显示E-cadherin表达与性别、年龄、肺癌病理类型、肿瘤原发灶状况(T-status)、肿瘤分化程度等均无明显关系(P＞0．05)。但E-cadherin的表达与患者的区域淋巴结转移状况(N-status)、TNM分期及吸烟状况明显相关(P＜0．05)。E-cadherin的表达下降是上皮细胞间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)过程的重要标志物。EMT是肿瘤细胞侵袭转移的重要机制，可以影响肿瘤患者预后［11］。EMT过程有着一系列特征性的改变:①形态学方面的改变，细胞由上皮细胞表型向间质细胞表型转变，梭形细胞、伪足增加;②细胞功能方面的改变，细胞转移侵袭能力增强;③分子生物学方面的改变，间质细胞标志蛋白N-钙黏蛋白(N-cadherin)，波形蛋白(vimentin)表达升高，而上皮细胞标志蛋白E-钙黏蛋白(E-cadherin)表达下降［12］。体内研究表明通过RNAi介导的E-cadherin下调足以诱导EMT，促使肿瘤细胞转移［13］。另外，本研究发现E-cadherin下降与患者的远处转移状况(M-status)无明显相关，这与Sorscher等［14］在33例原发和远处转移性NSCLC标本中应用免疫组化法检测E-cadherin表达的研究结果类似。这也说明与E-cadherin的表达相关的是淋巴结转移，而非远处转移，其具体的分子机制尚待进一步研究。

尤其值得注意的是，本研究发现E-cadherin的表达下降与吸烟严重程度明显相关。吸烟过程可产生4000多种化学物质，大约200种是有致癌性的，包括多环芳烃类化合物(PAH)及尼古丁等。其中采用香烟烟雾中重要致癌物B［a］P处理A549细胞后，E-cadherin表达下降，A549细胞出现EMT样改变。B［a］P启动和促进肺癌转移可能是通过促进Twist表达升高，然后，通过与E-cadherin促进子区E-boxes作用而下调E-cadherin表达，进而在EMT、肿瘤进展和转移起重要作用［15］。香烟烟雾中另外一种致癌物尼古丁也通过烟碱乙酰胆碱受体(a7-nAChRs)促进A549细胞转移，且有时间和剂量依赖性［16］。由此可见，E-cadherin表达下降可能是吸烟导致肺癌患者出现淋巴结转移的重要原因。

肿瘤引起的致死原因中90%是因为恶性肿瘤的转移［17］。以前的观点认为转移是癌症进展中的一个晚期事件，即在原发肿瘤细胞积累了一系列的基因变异之后才启动了癌症基因。然而，Podsypanina等［18］的实验结果提示，肿瘤的转移可能发生于疾病早期。吸烟的肺癌患者预后差，可能同香烟烟雾中的致癌物导致肺癌早期转移有很大关系。已经存在肺癌的前期病变或早期肿瘤的吸烟患者，如果仍在吸烟的情况下可能更易出现转移［19］。本研究的生存分析结果也表明E-cadherin表达下调的患者生存率明显下降。有研究应用酶联免疫法检测79例肺癌患者中E-cadherin血清水平，结果发现E-cadherin表达缺失与肺癌的进展相关，且E-cadherin诊断的特异性为90%，鳞癌、SCLC和腺癌的敏感性分别为66．6%、47．6%及43．7%［20］。这提示E-cadherin可作为检测肺癌转移与预后的一种标志物。

综上所述，在NSCLC中检测E-cadherin的表达，对判断肿瘤的淋巴结转移趋势、及判断患者预后有重要意义。E-cadherin表达下降可能是吸烟导致肺癌患者出现淋巴结转移的重要原因。

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