Rho/Rho激酶在肺癌中的作用及其潜在治疗靶点

吴冠楠 宋 勇

Rho蛋白在细胞内起到分子开关的作用，Rho/ROCK信号通路在细胞的粘附、变形、迁移、增殖、凋亡等多种行为方面起到重要调控作用。Rho蛋白的异常表达或激活被发现与肺癌细胞生物学特征和患者预后等有显著相关性，并可能成为潜在治疗靶点。现就Rho/ROCK信号通路在肺癌中的作用及其潜在治疗作用做一综述。

一、Rho相关信号通路

1．Rho蛋白与Rho激酶和mDia1:Rho蛋白或Rho GTP酶(Rho GTPase)是Ras超家族的组成之一，为小分子量(相对分子量20×103～30×103)GTP结合蛋白，目前已从哺乳动物中分离出20种Rho蛋白家族成员，分别为 Rho(RhoA、RhoB 和 RhoC)、Rac(Rac1、Rac2、Rac3和 RhoG)、Cdc42(Cdc42Hs、G25K 和 TC10)、Rnd(RhoE/Rnd3、Rnd1/Rho6 和 Rnd2/Rho7)、RhoD(RhoD 和 Rif)、RhoH/TTF、Wrch(Wrch-1和 Wrch-2)和 RhoBTB(RhoBTB1 和 RhoBTB2)亚型，其中以 Rho、Rac、Cdc42研究较为集中［1］。Rho蛋白在细胞内以两种状态存在，即与GTP结合状态(活化型)和与GDP结合状态(失活型)。与GTP结合的Rho蛋白主要定位于细胞膜，具有磷酸酶活性，并可以和效应分子相互作用，从而启动下游信号通路;与GDP结合的Rho蛋白主要定位于细胞质，为失活状态。调节Rho蛋白失活与活化状态转换的分子主要有以下两类:鸟苷酸转换因子(guanosine nucleotide exchange factors，GEFs)、GTP 酶激活蛋白(GTPase activating proteins，GAPs)。GEFs经一系列信号转导被激活后，催化Rho．GDP转化为Rho．GTP，从而使Rho蛋白被激活;GAPs则参与激活Rho．GTP本身的GTP酶活性，导致Rho．GTP水解为 Rho．GDP，从而使 Rho蛋白失活［2］。GEFs和GAPs具有相对特异性，如NET1的底物仅为RhoA，而GEF-H1的底物则包括RhoA、RhoB和RhoC，FilGAP的底物仅为Rac1，而p190-RhoGAP的底物则包括RhoA、RhoB和RhoC［3］。此外鸟苷酸游离抑制因子(guanosine nucleotide dissociation inhibitor，GDIs)也参与细胞内Rho蛋白活性的调节，GDIs可以和细胞内处于失活状态的Rho蛋白结合，增加Rho蛋白的稳定性［4］。

Rho激酶(Rho associated kinases，ROCKs)是Rho蛋白的主要效应分子，可被磷酸化而激活，它为一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，相对分子量约为160×103，ROCK分子结构主要分为三部分:N端的激酶结构域、中间的螺旋结构域和C端的PH结构域，其中Rho蛋白通过作用于C端的双螺旋部分而使ROCK激活，ROCK有两种异构体:ROCK1(ROCKβ)和ROCK2(ROCKα)，二者均分布广泛，但ROCK1在非神经组织中含量相对更高，而ROCK2在肌肉和大脑中含量相对更高［5］。

mDia1(mammalian diaphanous1)是黑腹果蝇翅膀中diaphanous蛋白的同源物，属于成蛋白(formin)相关蛋白家族，它是Rho蛋白除ROCK外的另一效应分子［6］。

2．Rho相关信号通路的生物学功能:Rho蛋白通过活化与失活状态之间的转换调节下游信号通路的开启与关闭，从而起到分子开关的作用。Rho/ROCK信号通路、Rho/mDia1信号通路和其他Rho相关信号通路在细胞骨架的调节中发挥重要作用，可以通过促进肌球蛋白轻链磷酸化、肌动蛋白聚集、调节微管等促进细胞收缩、聚集［5-6］。Machacek等［7］发现细胞移行过程中，在突触形成前，RhoA、Cdc42和Rac1在突触形成部位均被激活，其中以RhoA最先活化，而后于稍远离突出前端的2 μm部位，Cdc42和Rac1也被激活。三者活化程度与突触生长速度呈正比，RhoA的活化启动了突触的形成，而Cdc42和Rac1的活化则进一步促进突触的扩展。用血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)处理的内皮细胞中，RhoA、Cdc42和Rac1迅速被激活，暗示Rho蛋白可能是血管内皮生长因子受体(Vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)直接的下游分子之一。RhoA的活化可以抑制内皮细胞的屏障功能，RhoA、Cdc42和Rac1的活化可以促进血管基底膜的降解、内皮细胞增殖、移行以及毛细血管的形成，Rho蛋白在新生血管形成中发挥重要的作用［8］。多种信号周期调节蛋白均是Rho/ROCK信号通路下游分子，如细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白D3、细胞周期蛋白A、P21和P27等。RhoA、Cdc42和Rac1可调节其表达或活性，从而促进细胞的G1/S期转换，促进细胞增殖［8-9］。上皮细胞极性是其重要的特性之一，细胞极性丢失与细胞迁移、浸润和上皮细胞-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)等密切相关。Chartier等［10］研究发现，Rac1和PI3K的激活可以使上皮细胞丢失极性，抑制二者中的任意一个均可使该效应显著降低。

二、Rho与肺癌

目前，在多种肿瘤中均已发现Ras基因的突变。Rho虽然作为Ras超家族的一员，但其突变在肿瘤中并不多见，而Rho的异常表达和活化却常见于多种肿瘤［11］。在肺癌组织或细胞系中，Rho的表达异常和激活已被多个研究所证实。Touge等［12］研究发现，RhoA在大细胞肺癌细胞系中呈高表达，而在肺腺癌细胞系中表达相对较低，但RhoA在各种肺癌细胞系中均被显著激活，尤其以小细胞肺癌细胞系最为显著。癌性锚蛋白重复序列(gann ankyrin repeats)蛋白是新近发现的肿瘤蛋白，Man等［13］研究发现，在Ras突变的肺癌中，gankyrin表达量显著增高，增高的gankyrin促进RhoA与GDIs结合，从而使得游离状态RhoA减少，抑制RhoA/ROCK/PTEN信号通路，从而导致Akt的持续活化，后者则是Ras突变诱导细胞转化及肿瘤形成的关键。上皮细胞钙黏蛋白(E-cadherin)可以抑制非小细胞肺癌(non-small cell lung cancers，NSCLC)细胞的增殖和浸润，Asnaghi等［14］研究发现，E-cadherin抑制NSCLC细胞增殖作用主要是通过下调RhoA或Cdc42的表达。敲除RhoA或Cdc42基因后，NSCLC细胞增殖和浸润能力均显著下降。肺癌患者的预后与其分期密切相关，Chen等［15］发现，肺癌患者的癌组织中Cdc42呈过表达，而且Cdc42过表达与患者的高TNM分期和高淋巴结转移存在显著相关性，抑制Cdc42的表达可以抑制肺癌细胞系801D的迁移、浸润等。K-Ras基因是重要的原癌基因，K-Ras基因突变在肺癌的发生中起到重要作用。Kissil等［16］研究发现Rac1在K-Ras突变诱导的肺癌中发挥关键作用，Rac1敲除可导致K-Ras突变上皮细胞的增值能力大幅度下降。转移是肺癌的一大特征，Ikoma等［17］研究发现肺癌组织中RhoC表达增加，过表达的RhoC并不影响肺癌细胞的生长和增值，但可显著增加肺癌细胞的迁移和浸润能力，并促进其基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)的合成和分泌，并增加MMP-2的活性。由此可见，部分起到“促癌”作用的Rho蛋白不仅在肺癌的发生中起到重要作用，更可能与肺癌细胞增值、迁移、浸润、肿瘤血管形成、癌栓形成、EMT等相关，从而与肺癌的转移密切相关。

与RhoA、Cdc42和Rac1等在肺癌中的“促癌”不同，RhoB具有潜在的“抑癌”作用。Mazieres等［18］研究发现，随着肺癌浸润性增高，RhoB在癌组织中的表达量大幅度下降，同时RhoB表达丢失与肺癌的高分期、高浸润性、低分化、高增值指数等存在显著相关性，而经处理的RhoB过表达的A549细胞的增殖、生长等均显著下降。随后的研究发现，肺癌中RhoB的低表达或不表达主要是由组蛋白低乙酰化所引起，在应用组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)抑制剂处理后的肺癌细胞系中可见显著的RhoB复表达［19］。而RhoB低表达可促进支气管上皮细胞的迁移和浸润，其主要是通过激活AKT1并依赖于Rac1的激活，从而导致PI3K/AKT信号通路被激活［20］。Howe等［21］研究发现，RhoB在内皮细胞的迁移、出芽和毛细血管形成中发挥重要作用，其部分机制为抑制RhoA/ROCK信号通路。由此可见，RhoB表达丢失可能是肺癌细胞获得浸润性的特征之一，其作用机制可能和PI3K/AKT信号通路被激活有关，而且Rho蛋白的调控网络可能也发挥重要作用。

三、Rho相关药物在肺癌治疗中的潜在作用

法舒地尔(fasudil)为Rho激酶的抑制剂，具有广泛的药理作用。A549细胞是人肺腺癌上皮细胞系，Zhu等［22］研究发现，法舒地尔可以抑制A549细胞MMP-2和MMP-9的活性，并且下调RhoA和VEGF的表达，抑制A549细胞的增殖、移行和浸润等生物学行为。NCI-H446细胞为人小细胞肺癌细胞系，Yang等［23］研究发现，法舒地尔可以抑制NCI-H446细胞的MMP-2和MMP-9的活性，并促进caspase3的活化和过氧化物酶增殖体活化受体(peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR)的降解，促进细胞凋亡。法舒地尔还可以抑制NCI-H446细胞的生长、增值、黏附、移行、浸润等生物学行为。VEGF诱导的内皮细胞移行是肿瘤血管形成和肿瘤血管转移的重要部分。Yin等［24］研究发现，法舒地尔可以抑制人脐带血管内皮细胞张力丝形成、黏着斑聚集及其酪氨酸激酶活性，从而抑制VEGF诱导内皮细胞的移行、抗凋亡和内皮细胞管道化作用，抑制肿瘤血管的形成。而且法舒地尔可以抑制VEGF诱导的肌球蛋白轻链磷酸化，从而影响肿瘤新生血管的功能。法舒地尔在体外实验中对肺癌细胞和对新生血管的抑制作用已被证实，但其确切的分子机制尚未明确，而且目前尚缺乏令人信服的法舒地尔对肺癌治疗作用的相关体内试验。但法舒地尔治疗其他恶性肿瘤的动物试验结果显示，法舒地尔可以抑制恶性肿瘤在动物模型体内的转移。Ying等［25］研究发现，在小鼠肝癌腹膜播散模型中，法舒地尔可显著减少腹膜癌结节数量和腹水的形成，在人纤维肉瘤肺转移小鼠模型中，法舒地尔可显著减少肺部转移灶的数量。在原位乳腺癌细胞接种小鼠模型中，法舒地尔也可以显著减少癌结节数量。但该研究同样显示出法舒地尔的抑制作用与结节大小成反比的趋势，提示法舒地尔主要作用于肿瘤转移的早期，其预防转移的意义可能更大。

羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶抑制剂(HMG-CoA reductase inhibitor)，即他汀类(statins)药物，具有广泛的药理作用。他汀类药物主要可通过抑制类异戊二烯的合成而影响Rho的膜定位，抑制Rho蛋白的活化，从而阻断相关信号通路活化下游效应分子［26］。Zhao等［27］研究发现。洛伐他汀(lovastatin)可抑制RhoA等Rho蛋白的活化，从而抑制EGFR二聚体的形成和AKT的活化，洛伐他汀和吉非替尼(gefitinib)在多种肿瘤细胞系中均表现出协同的细胞毒性作用，但对于三期NSCLC患者的临床资料研究显示，洛伐他汀并未增加厄洛替尼临床疗效，但洛伐他汀联合厄洛替尼有改善预后的趋势，二者生存曲线分离相对较明显［27］。

四、小结

肺癌转移是其导致患者死亡的主要原因之一，Rho在细胞中的作用极其广泛，且存在复杂的调控网络，参与调解细胞的多种生物学功能，在肺癌的发生、发展中也发挥重要的作用，尤其在肺癌的转移中发挥重要作用，但其具体机制尚有待进一步研究。目前法舒地尔、他汀类药物是潜在的可用于肺癌辅助治疗的药物，法舒地尔对肺癌的治疗作用主要集中于体外实验，而对其主要作用机制、体内试验、临床研究等尚有待进一步研究。他汀类药物的体外实验同样显示其对细胞毒性的协同作用，但目前相关的回顾性临床研究结果并不支持其作为三期NSCLC患者的辅助治疗，相关研究中合用洛伐他汀的病例总数也过少，而且并非临床随机对照(randomized controlled trial，RCT)研究，目前尚需进一步的、更大样本量、患者临床特征相对局限的RCT研究。

RhoA可以促进EGFR形成二聚体，RhoB可以抑制AKT活化。RhoA、Rac1也可以促进AKT活化。Rho与EGFR和AKT的相互作用也可能会成为肺癌治疗，尤其是对EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR tyrosine kinase inhibitor)耐药患者治疗的新的突破点。

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