晚期非小细胞肺癌患者体液标本表皮生长因子受体突变基因检测的进展

王 沣 操乐杰

尽管肺癌的诊断、分期、治疗日趋规范化，但由于缺乏有效的早期筛查制度和方法，加之传统化疗的疗效出现平台期，导致肺癌患者总体预后依然很差，5年生存率仅为16%［1］。随着分子肿瘤学的发展，发现表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)是原癌基因c-erbB1的表达产物，其突变参与了肿瘤的生长、侵袭等过程。针对这一靶点的药物酪氨酸激酶抑制剂(如吉非替尼、埃克替尼等)开创了肺癌分子靶向治疗的先河。临床实践证明非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)患者间存在分子靶向药物疗效上的差异，这种差异主要体现在肺癌患者体细胞EGFR是否存在分子突变。而发生分子突变的患者疗效极佳，可见突变检测对选择合适人群进行靶向治疗具有重大意义。过去对EGFR突变检测多是基于组织标本，但晚期肺癌患者组织标本往往很难获得，因此找到一种理想的标本，建立合适的检测方法进行EGFR突变检测是当前研究的热点。现就NSCLC患者极易反复获取的体液标本中的EGFR基因突变检测及意义加以综述。

一、EGFR的常用检测方法

直接测序法被公认为是EGFR基因检测的“金标准”，该法能确切判断突变碱基及突变位置，而且可以发现新的突变基因。但被测标本DNA纯度要求不能低于30%突变才能检出，因而，往往需要选用微切割肿瘤组织标本［2］。为了满足临床的广泛需求，国内外学者应用不同EGFR检测方法对晚期NSCLC患者的体液标本进行过尝试，目前报道较多的三种是蝎形探针扩增阻滞突变法(SARMS法)、突变体富集法PCR、变性高效液相色谱技术(DHPLC法)。

1．SARMS法:该方法引入了应用于等位基因鉴定的Scorpions蝎形结构特异性探针。该探针包含一个与3'，端共价相连的PCR引物，仅仅能识别突变序列，而不识别正常序列，附加错配突变设计在3'，端引物序列中，从而实现特异性的扩增。Scorpions探针与ARMS技术联合应用比常见的荧光探针PCR技术更为先进，其可检测单个突变，提高了方法的特异性及检测结果的可靠性。国内厦门艾德公司在基于实时PCR平台的基础上结合了特异引物和双环探针两种技术，建立了ADx特异扩增技术。该试剂盒与国际公认EGFR检测试剂盒在检测灵敏度及检测结果的一致性上已经被国内多家医院所验证，有望使SARMS法对EGFR突变的检测实验过程更加快捷，费用更经济。但SARMS法也有局限，它是针对已知突变基因进行相应探针的设计，因此无法检测未知突变基因。

2．突变体富集PCR法:该方法基本原理是利用ras基因家族某个密码子部位存在已知的限制性内切酶位点，在两次扩增反应之间用相应的内切酶消化野生型的EGFR基因片断，野生型因被酶切而不能进入第二次PCR扩增，而突变型则能完整进入第二次PCR扩增，从而实现产物的富集，再使用PCR放大和凝胶电泳技术，根据产物的大小进行突变的判断。该方法同样是基于PCR技术，因此实验过程中避免污染尤其重要，目前该方法主要用于19、21外显子的基因突变检测，不能检测约占全部突变10%左右的其他EGFR基因的突变。

3．DHPLC法:变性高效液相色谱技术是近年来国内外兴起的一种用于分析核苷酸片段的技术平台。该系统可在非变性、部分变性、完全变性三种条件下运行，其中部分变性条件适用于EGFR基因突变的检测，能分离、识别野生型及突变型DNA双链。DHPLC法在EGFR突变基因检测峰型中易于判读，且有利于发现未知突变基因，具有快速、高通量、操作简单、费用低廉等优点，该方法不足的是只能检测有无突变，而不能区分突变类型。

二、不同标本中EGFR突变基因检测在临床的应用

1．外周血标本中EGFR突变基因的检测

早在1977年，Leon等［3］已发现肿瘤患者血清、血浆中循环DNA含量明显高于健康人群。其来源可能与原发肿瘤的释放、外周循环中肿瘤微转移灶的释放、肿瘤细胞凋亡或坏死释放有关［4］。采用PCR探针技术和荧光技术，对肺癌患者外周血标本进行EGFR突变基因检测，在试验设计中应尽可能的将血和肿瘤组织进行匹配或者对同一类型标本采用不同方法检测，并通过观察分子靶向治疗效果以验证循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTC)及外周血游离DNA(cell free DNA，cfDNA)中EGFR突变基因检测结果的可靠性。

(1)外周血游离DNA(cfDNA):指外周血细胞外DNA，存在于血清、血浆中的游离DNA都可用来检测EGFR突变基因。二者的优劣性采用血浆似乎要比血清更好，这可能与血清中的混合成分有关，有研究称随着炎性细胞数量的增加，血清循环DNA比例增加，而血浆并非如此［5］。血标本具有获取方便的优点，但容易被污染。相关研究表明cfDNA被污染量与标本采集后血清、血浆分离时间成正相关［6］。此外cfDNA稳定性较差，血清、血浆cfDNA标本在处理前应保存于－20℃或是更低的环境，且浓度波动范围很大(10～1200 ng/ml)，片段短(－180 bp)，由肿瘤细胞凋亡、坏死产生的cfDNA在总cfDNA中的比例不等(3% ～93%)，不同肿瘤类型cfDNA的比例亦不一致，并且与肿瘤的分期、分级、大小及位置有关。鉴于以上特点，cfDNA用于基因检测对方法的选择要求很高，直接测序法存在着很大的局限性。Kimura等［7］研究发现cfDNA在血标本中敏感度仅为66%，特异度为71%，这可能会导致部分EGFR突变阳性的患者因为检测方法选择不当而失去谷氨酸转移酶抑制剂治疗的机会。较敏感检测方法SARMS法在cfDNA的应用报道较多，2007年Kimura报道采用SARMS法检测cfDNA样本中EGFR的敏感性为85%，特异性94%，肿瘤组织和血标本突变检测结果一致率高达92．9%［8］。在用血清标本中检测EGFR阳性的患者给予吉非替尼治疗获得的中位 PFS明显长于 EGFR阴性的患者(174 d vs 58 d，P=0．044)。在此之后Maheswaran报道12例肺癌患者游离血浆标本中有4例EGFR阳性［9］。Liu等［10］对18例血浆标本中用SARMS法突变检出率为80%。以上研究所示的突变检出率波动幅度很大，其原因可能与入组的条件等有关，其中肿瘤的分期也影响着EGFR突变检测结果。Bai等［11］对230例ⅢB期-Ⅳ期NSCLC肿瘤组织和cfDNA标本使用DHPLC法进行了19、21号外显子EGFR突变分析，结果显示cfDNA和相匹配的肿瘤组织突变一致性达79．7%。此外Yung等［12］对微数字PCR方法进行过尝试，该法能检测单个突变DNA分子，并可精确地区别突变和野生型序列，对血浆标本中EGFR突变检测的敏感性和特异性能达到92%和100%，较SARMS法更适合EGFR突变检测。

目前突变体富集PCR法应用较广泛。惠福海等［13］应用突变体富集PCR法检测EGFR基因21号染色体突变情况，在23例肿瘤组织中有8例突变阳性，其中采用cfDNA检测中7例得到一致结果(87．5%)。突变体富集PCR法实现了产物的富集，He等［14］在此基础上联合采用直接测序法，在血浆cfDNA中发现19、21外显子EGFR突变检出率达49．3%，与配对的肿瘤组织检测结果一致性为94．4%。cfDNA中EGFR突变阳性较野生型患者在应用吉非替尼二线治疗后PFS有很大差异(7．609个月vs 2．877个月，P=0．002)。Jiang等［15］证实对cfDNA采用突变体富集PCR检测EGFR突变结果和组织标本中检测结果的一致性可达93．1%，且cfDNA中突变体富集法的敏感性和特异性分别为77．8% 和100%，相反非富集PCR技术的敏感性和特异性则要逊色很多。

(2)外周血循环肿瘤细胞(circulating tumor cell，CTC):外周血成份复杂，为了降低检测结果的假阳性，产品的纯化十分必要。通常每毫升血中CTC数量仅为1～10个，这较混合存在的白细胞及红细胞数量少很多，导致检测难度较大。相对较成熟的CTC浓缩检测技术是近年来发展起来的一种较好的方法。

CTC检测在乳腺癌、结肠癌等癌症患者中涉及颇广。Maheswaran等［9］基于微流体技术设计了一个分离、纯化芯片，针对上皮细胞黏附分子(EpCAM)的抗体，分离出NSCLC患者CTC，并对分离后的CTC采用SARMS法进行EGFR基因突变检测，发现其灵敏度达92%。CTC标本在EGFR突变检出灵敏度方面较cfDNA标本高，但其肿瘤细胞的纯化技术复杂，目前难以推广，其优越性有待进一步证实。

采用NSCLC患者外周血标本进行EGFR基因突变检测具有可行性，cfDNA标本较CTC标本在目前的应用更为广泛。血标本EGFR基因突变检测结果对指导临床治疗很有价值。鉴于标本自身的特点，对检测方法而言敏感性较高的SARMS法及突变体富集PCR法更受青睐，尤其是采用试剂盒的SARMS法在操作上更有明显优越性。

2．胸腔积液标本中EGFR突变基因的检测

恶性胸腔积液在各类型肺癌中很常见，尤其在肺腺癌中更为多见，其形成往往与肿瘤的直接侵犯或是胸膜转移有关，合并积液的患者往往提示肿瘤晚期不能接受外科手术［16］。研究发现胸腔积液脱落细胞是检测致癌基因点突变很有价值的标本，很多学者对此类标本用作EGFR基因突变检测进行了探讨。

(1)胸腔积液DNA片段游离细胞(cell-free pleural fluid):恶性胸腔积液中往往存在着片段DNA，但其浓度很低，Kimura等［17］收集了43例ⅢB-Ⅳ期NSCLC患者的胸腔积液游离细胞标本，应用直接测序法对EGFR18-21号外显子进行了突变分析，突变检出率为25．6%，其中女性、非吸烟人群检出率较高。该组中的27例患者给予吉非替尼靶向治疗后病灶达到PR、SD的各有7例，检测结果均为突变阳性。而突变阴性的患者均为疾病持续进展者。Wu等［18］采用直接测序法在该类标本中的突变检出率达高68．4%，这一差异可能是所检测的范围和入组的条件不同所致。

何臣等［19］对30例NSCLC患者胸腔积液游离DNA进行了EGFR19及21外显子突变分析，并比较了酶切富集PCR法及非酶切富集PCR法对胸腔积液EGFR基因突变检出率的差异。结果证实酶切富集PCR法的检测灵敏性显著高于非酶切富集PCR法(50．0%vs 23．3%)，这一结果与Zhang等［20］报道的检出率相当(50．0%vs 31．0%)。酶切富集PCR法对胸腔积液DNA游离细胞标本EGFR突变基因检测是一种较直接测序法更为灵敏、简便可行、能解决问题且费用低廉的方法，具有临床应用价值。

(2)胸腔积液细胞(pleural effusion cells):由于肺癌胸腔积液标本包含有突变成分、正常细胞、炎症细胞及间皮细胞等混合成分，导致DNA纯度不够，入组的患者检出突变率多较低。Kimura等［21］收集了24例NSCLC患者的胸腔积液，采用胸腔积液细胞，同时应用直接测序法和敏感性较高的SARMS法对EGFR18-21号外显子突变基因进行检测。共检测出8例突变阳性患者，其中有3例在两种方法中出现一致的结果，而另外5例仅在敏感性高的SARMS法检测中出现阳性突变。值得关注的是在入组的患者中有7例得到吉非替尼治疗，其中4例达到PR，直接测序法检测到阳性的患者只有2例达到PR。在此研究中直接测序法突变检出率仅为12．5%，而SARMS法突变检出率为33．3%。这预示恶性胸腔液是一种可选的被检测标本类型，SARMS法灵敏度明显高于直接测序法。值得注意的是Zhang等［20］对胸腔积液无细胞悬液和脱落细胞沉渣两种标本EGFR基因突变检测结果进行了比较，发现二者在敏感性高的突变体富集PCR方法中检测结果具有一致性。

在异质性高的胸腔积液标本中，敏感性较高的SARMS法和突变体富集PCR法检测拥有较大的优势。胸腔积液标本的留取、储藏较为简便，和石蜡组织标本比较更为新鲜，而且该类标本EGFR阳性检测结果有指导临床靶向治疗的价值。

3．其他:支气管镜检查、痰液检查是临床诊断肺癌的重要手段，但面临的困难依然是不能获得足够的组织以满足病理评估后的基因分析。Hiroyuki等［22］收集了61例肺癌患者的支气管内膜上皮细胞衬液标本，应用PNA-LNA钳夹法进行了EGFR突变检测，结果发现检测敏感率达58．3%。该方法简单、安全，且未直接接触瘤体，在进行活检、灌洗、刷片前只需用一微量样本采集探针进行上皮细胞衬液采集即可，避免了血液杂合成分的影响。表明气管镜采集微量标本是另外一种检测肿瘤基因改变的补充方法。痰液标本含有呼吸道上皮脱落细胞，是容易获得的生物学标本。痰细胞学已用于肺癌的诊断分析，但肿瘤相关细胞DNA或游离DNA量相对于炎性细胞DNA的量较少，因而目前尚未见到以该类标本进行EGFR基因突变检测的相关文献。

对NSCLC患者接受TKI治疗前进行EGFR基因突变基因的筛选，无论采用哪种标本类型，应保证足够多的肿瘤细胞，尽量剔除非肿瘤细胞。突变检测的方法及细胞纯化的技术尚有待进一步改进，体液标本与组织标本检测结果的一致性及体液标本突变阳性患者靶向获益的情况报道不一，尚需更多的研究进一步证实。对于不能获得组织标本的NSCLC患者应用外周血、胸腔积液等体液标本进行EGFR突变基因检测将为患者TKI治疗提供有价值的依据。

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