阿托伐他汀对脓毒症大鼠血浆IL-1β的影响

顾金萍，于 健, 王俊松，王之余，曲茂兴

(1.大连医科大学 附属第二医院 重症医学科， 辽宁 大连 116027；2.大连大学 附属新华医院 重症监护病房， 辽宁 大连116001)

脓毒症(Sepsis)是由感染引起的临床疾病，为机体局部感染，毒素吸收或者病原微生物直接入血弥漫全身所致。是严重创伤、休克、感染、外科大手术患者常见的并发症，进一步发展可导致脓毒性休克、多器官功能障碍综合征，是临床危重患者最主要的死亡原因之一[1]，而Sepsis是否引起死亡主要取决于机体对炎症的反应及其炎症因子的释放强度。目前，对脓毒症的发病机制尚未完全阐明，病因治疗、液体复苏、血管活性药物治疗、抗生素的使用及抗凝治疗等仍然是目前的主要治疗手段，尽管上述治疗手段不断改进，但脓毒症或脓毒性休克的死亡率仍居高不下，为30%～50%[2]。

他汀类药物是目前广泛应用的调脂药物，临床上主要用于高脂血症、冠心病等疾病的治疗。但是近期的研究显示他汀类药物对内毒素血症的患者有益。脓毒症是细菌感染的严重阶段，涉及到多种炎症因子的释放，如肿瘤坏死因子α(TNF-α)，白细胞介素1、6、8(IL-1,IL-6,IL-8)等,而他汀类药物改善患者的预后可能与抑制炎症因子的释放有关。本研究的目的是观察他汀类药物对脓毒症小鼠血IL-1β浓度的影响，从而进一步明确他汀类药物干预炎症过程的机制。本实验采用盲肠结扎穿孔术(CPL)建立脓毒症大鼠模型，动态观察IL-1β的变化以及阿托伐他汀对它们的影响，探讨他汀类调脂药对于脓毒症临床治疗的应用价值。

1 材料和方法

1.1 仪器设备

DS-88型电子秤(武汉自动化仪表厂)，TG16WS高速台式离心机(长沙科学仪器厂)，HH-W21-600电热恒温水浴箱(上海医用恒温设备厂)，迈瑞MR96A酶标仪。

1.2 试剂和材料

阿托伐他汀(立普妥)，20 mg/片，大连辉瑞制药有限公司生产，批号081128。麻醉剂：3%戊巴比妥钠。制作模型的耗材：爱惜康(黑色)编织非吸收性缝线，15 cm×60 cm，由Johnson 公司生产。KGERC102a凯基大鼠IL-1β ELISA 试剂盒，由南京凯基生物科技发展有限公司生产。

1.3 实验动物分组及给药

100只健康雄性S-D(Sprague-Dawley)大鼠，体质量184～202 g，购于大连医科大学实验动物中心。在实验室内饲养，环境温度22～25 ℃，空气湿度40%～70%。每5只大鼠置一笼(475 mm×300 mm×200 mm)，在笼内自由活动，摄取全价配合饲料(大连医科大学实验动物中心提供)并自由饮水，自然长度的昼夜循环。按照随机排列表法分为对照组，脓毒症组，阿托伐他汀低剂量组，阿托伐他汀高剂量组，每组25只。对照组用淀粉40 mg/kg·d加入2 mL生理盐水制成混悬液灌胃5 d，术前禁食12 h，腹腔注射3%戊巴比妥钠45 mg/kg麻醉，无菌条件下取下腹正中切口2 cm，翻动盲肠后还纳腹腔，逐层缝合切口，置笼内活动，不禁饮食。脓毒症组术前灌胃与对照组相同，采用盲肠结扎穿孔术(cecal ligation and puncture, CLP)制作脓毒症大鼠模型。阿托伐他汀低剂量组用研钵粉碎阿托伐他汀，以20 mg/kg·d加入2 mL生理盐水制成混悬液连续灌胃5 d，采用CLP制作脓毒症大鼠模型。阿托伐他汀高剂量组用研钵粉碎阿托伐他汀，以40 mg/kg·d加入2 mL生理盐水制成混悬液连续灌胃5 d，采用CLP制作脓毒症大鼠模型[3]。

1.4 盲肠结扎穿孔术(CLP)

术前禁食12 h，腹腔注射3%戊巴比妥钠45 mg/kg麻醉，无菌条件下取下腹正中切口2 cm，暴露盲肠，用丝线结扎盲肠总长度的30%[4]，注意避开系膜血管，9号注射针头在盲肠游离端选2个相距3 mm点分别刺孔穿透盲肠，然后将盲肠还纳腹腔，逐层缝合切口，即刻皮下注射生理盐水3 mL/100 mg体重以补充术中丢失的液体。术后置笼内活动，不禁饮食。

1.5 大鼠脓毒症严重程度评分标准

采用改良的评定标准[5]进行评分。见表1。

1.6 标本收集

分别于术后0，3，6，12及24 h 各取5只大鼠麻醉后，剪去一侧颈部外侧被毛，剪开皮肤，剥离组织，找到颈静脉或动脉后，用注射器采血，在采血管中再静置30 min, 4 ℃以4000 r/min离心15 min, 分离出血浆后-80 ℃冰箱中保存。

1.7 标本检测

IL-1β应用凯基大鼠 IL-1β ELISA 试剂盒测定。

1.8 组织病理观察

各组分别在术后0、24 h留取空肠标本，置10%甲醛溶液中固定，依次进行常规脱水、石蜡包埋、制成切片、苏木精-伊红(HE)染色后，光镜下观察。

1.9 统计学方法

采用SPSS 13.0软件包进行统计学处理，计量资料以均数±标准差表示，正态分布变量多组间的比较用方差分析，非正态分布变量用秩和检验，4个处理组之间均数两两比较用LSD-t检验法，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 大鼠一般情况

脓毒症大鼠逐渐出现活动少，不再扎堆取暖，冷漠，皮毛失去光泽，停止饮水，竖毛，有些大鼠呼吸快，眼睛变双环，对被动仰卧无反抗，感觉迟钝，短期内病死率高。腹腔肠系膜充血，肠管显著扩张，结扎盲肠坏死，血性腹水，病灶处大网膜包裹不佳，肝肿大，肺表面充血明显等。低剂量阿托伐他汀组出现厌食，竖毛，活动少甚至不活动等情况，肠管轻度扩张，腹水微臭，坏死盲肠被大网膜及周围肠管包裹良好，但局部可见坏死。高剂量阿托伐他汀组亦出现厌食，竖毛，活动少等情况，肠管轻度扩张腹水减少，坏死盲肠被大网膜及周围肠管包裹明显，对照组没有相关表现。各组大鼠脓毒症严重程度评分见表2。

表2 四组大鼠脓毒症严重程度评分比较Tab 2 Comparison of sepsis severity scale in four groups

1)与对照组相比，P<0.01；2)与脓毒症组相比，P<0.01；3)与低剂量组比，P<0.01

2.2 各组血浆IL-1β浓度的比较

0 h各组血浆IL-1β浓度比较差异无显著性意义(P=0.772，P>0.05)。对照组血浆IL-1β浓度变化不明显，在3 h、6 h、12 h、24 h脓毒症组和对照组、阿托伐他汀低剂量组、阿托伐他汀高剂量组比较差异均有显著性意义(P<0.01)。脓毒症组血浆IL-1β浓度在术后3 h显著升高，6 h达到峰值(1373.90±495.26)ng/L之后逐渐下降。阿托伐他汀组血浆IL-1β浓度同样在术后3 h显著升高，在6 h达到峰值，低剂量组(876.70±137.87)ng/L，高剂量组(669.40±71.23)ng/L，较脓毒症组明显降低(P低=0.001，P高=0.001，P均<0.01)，差异具有非常显著性意义。12 h阿托伐他汀高剂量组较阿托伐他汀低剂量组血浆IL-1β浓度明显降低(P=0.002，P<0.01)，差异具有非常显著性意义。24 h阿托伐他汀高剂量组较阿托伐他汀低剂量组血浆IL-1β浓度也有明显降低(P=0.042，P<0.05)，差异具有显著性意义。见表3。

表3 阿托伐他汀对脓毒症大鼠血浆IL-1β浓度的影响Tab 3 Effect on the plasma levels of IL-1β in sepsis rat (ng/L)

1)与对照组相比，P<0.01;2)与脓毒症组相比，P<0.01;3)与低剂量组相比，P<0.01;4)与低剂量组相比，P<0.05

2.3 大鼠大体解剖检查

对照组无明显病理改变。脓毒症组均出现严重的腹腔炎症，腹腔内有多量浑浊脓性渗出液，可见有血性腹水，肠管水肿粘连，盲肠肿胀坏疽，肝、肾充血肿大。阿托伐他汀低剂量组脓性渗出液略少，肠管粘连较脓毒症组轻，盲肠肿胀坏疽减轻。高剂量组较低剂量组脓性渗出液少，盲肠肿胀坏疽轻。

2.4 光学显微镜下小肠的病理改变

对照组肠黏膜正常。脓毒症组肠黏膜部分上皮脱落，重度炎症。阿托伐他汀组肠黏膜中度炎症。高剂量组较低剂量组炎症程度减轻。见图1。

图1 大鼠小肠24 h病理改变(HE ×200)Fig 1 Pathological change on small intestine of rats after 24 h (HE ×200)

3 讨 论

脓毒症是由感染引起的全身炎症反应综合征，其过程涉及炎症、免疫、凝血及组织损害等一系列的机体变化，最终导致多器官功能衰竭。虽然近年来对人体炎症反应的病理生理有了突破性的认识，并采取了一些有效的治疗技术，但是重症脓毒症的死亡率仍然保持在40%[6]，在合并脏器衰竭和休克的患者，有些甚至已超过了50%。免疫系统参与了脓毒症的发病过程，近年来的研究显示[7]，脓毒症表现为两个阶段，第一阶段主要为前炎因子的表达，如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，白细胞介素-1(IL-1)， 白细胞介素-8(IL-8)，白细胞介素-12(IL-12), 可能有白细胞介素-6(IL-6)的表达，对有效的炎症反应来说，前炎因子是有益的，但是过度的表达就导致了器官功能不全，增加了死亡率；而在第二阶段，抗炎因子，如白细胞介素-10(IL-10)，白细胞介素-13(IL-13)，白细胞介素-4(IL-4)和前列环素E2的释放中和了炎症反应，使其避免过度的表达，以致造成器官功能损害。美国学者Bone[8]于20世纪90年代中期提出了代偿性抗炎反应综合征的假说， 指出脓毒血症患者存在不同的免疫状态(包括免疫抑制)，主要取决于促炎细胞因子与抗炎细胞因子的平衡，免疫抑制是由于抗炎因子占优势所致。20世纪70年代在对免疫应答的研究过程中，人们从丝裂源刺激的细胞培养上清液中发现了许多的具有生物活性的分子，包括IL-1，研究表明LPS是单核∕巨噬细胞合成和分泌IL-1的强烈刺激剂，研究IL-1在脓毒症发病机制中的作用发现IL-1可通过多种途径产生多种效应来介导机体炎症反应。IL-1分子量为17.5 kD，有两种类型：IL-1α和IL-1β，主要以IL-1β为主。所以本实验研究阿托伐他汀对脓毒症大鼠IL-1β的影响，以了解阿托伐他汀是否会影响脓毒症大鼠IL-1β水平，从而对抗脓毒症治疗有影响。

他汀类药物是羟甲基戊二酸辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂，干扰胆固醇代谢，是目前广泛应用的调脂药物，临床上主要用于高脂血症、冠心病等疾病的治疗。但是大量研究证明他汀类药物对脓毒症有益。首先在一些动物实验中得到证明，Merx等[9]采用盲肠结扎穿孔术(CLP)复制小鼠脓毒症模型, 研究表明, 经过他汀类药物预处理的小鼠的平均存活率是对照组的4倍。实验动物制造模型的方法既往有利用细菌脂多糖诱导的方法。本研究采用CLP法复制脓毒症动物模型，其机理是通过盲肠的结扎和穿孔，使有菌的肠内容物污染腹腔造成弥漫性腹膜炎，诱发全身炎症反应，与利用细菌脂多糖(LPS)诱导的大鼠休克模型进行的研究相比，更能反映脓毒症的病理生理变化，更贴近于临床。因为在临床上调脂药物中阿托伐他汀疗效确切，应用广泛，所以本研究中调脂药物选择了阿托伐他汀，而不是其他调脂药物。本研究结果提示脓毒症组的大鼠逐渐出现活动少，不再扎堆取暖，冷漠，皮毛失去光泽，停止饮水，竖毛。阿托伐他汀低剂量组出现厌食，竖毛，活动少甚至不活动，肠管轻度扩张，腹水微臭，坏死盲肠被大网膜及周围肠管包裹良好，但局部可见坏死。高剂量阿托伐他汀组亦出现厌食，竖毛，活动少等情况，肠管轻度扩张腹水减少，坏死盲肠被大网膜及周围肠管包裹明显。可能提示阿托伐他汀有抑制脓毒症反应的作用。本研究结果提示，脓毒症组IL-1β较阿托伐他汀组均明显升高，并且高剂量阿托伐他汀组的IL-1β低于低剂量组，提示阿托伐他汀可能具有抗脓毒症作用。比较大鼠大体解剖发现对照组无明显病理改变。脓毒症组均出现严重的腹腔炎症，腹腔内有多量浑浊脓性渗出液，可见有血性腹水，肠管水肿粘连，盲肠肿胀坏疽，肝、肾充血肿大。比较光学显微镜下小肠的病理改变，发现对照组肠黏膜正常。脓毒症组肠黏膜部分上皮脱落，重度炎症。阿托伐他汀组肠黏膜中度炎症。高剂量组较低剂量组炎症程度减轻。进一步提示阿托伐他汀可以抑制动物脓毒症反应，主要体现在动物表现以及血浆IL-1β的治疗有益方面。不只是在动物实验中证明有效，越来越多的临床研究显示，他汀类药物不但有降脂作用，还可以抑制炎性因子的释放，抑制炎性细胞的黏附，降低脓毒血症的发生率和病死率[10]。一项前瞻性研究证实，患有急性细菌感染的患者，若预先服用他汀类药物，则严重脓毒症的发病率及ICU住院率均下降[11]。Thomsen等[12]研究阿托伐他汀对细菌感染后患者的短期病死率没有影响，但是却可以明显改善细菌感染后30～180 d的病死率 。有关他汀类药物成为近年脓毒症治疗研究的热点，其主要机制之一可能与保护血管内皮功能有关。有临床观察研究表明，他汀类药物治疗对脓毒症患者有益。Kruger等[13]对438例患者中66例 (占总人群的15%)入院前正在服用他汀类药物，而且其中85%患者入院后仍继续接受他汀类药物治疗进行的回顾性调查研究发现，他汀类药物治疗对脓毒症患者有益，他汀治疗组与对照组相比，28 d总病死率(10.6% vs 23.1%，P=0.022)和由脓毒症所致的病死率(6.1% vs18.3%,P=0.014)显著下降。Almog等[14]在对肺炎、泌尿系感染和蜂窝织炎患者(这些患者的APACHEⅡ评分11.1±7.2)的前瞻性队列研究中也表明，他汀类药物可降低严重脓毒症发生率和ICU住院率。虽然目前大多数的研究结果支持他汀类药物能改善脓毒血症的预后，但需要有大样本的前瞻性的随机对照研究结果来证实。

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