烟草抗病毒相关R基因RNAi表达载体的构建

杨 帆，李凤霞，孙玉合，王 鲁，杨爱国，苏振刚，李元元，赵百英，刘 慧，王元英*

（1.中国农业科学院烟草研究所，烟草遗传改良与生物技术重点开放实验室，青岛 266101；2.中国农业科学院研究生院，北京 100081）

烟草病毒病是一类危害烟草的世界性病害，早期发病损失可达50%～70%，甚至绝收，烟草病毒病的防治已成为生产上迫切需要解决的问题。RNAi即 RNA干涉，属于转录后水平的基因沉默（post transcriptional gene silencing，PTGS），是转录后产生的mRNA特异性的降解机制[1]。RNAi普遍存在于植物[2-3]、动物[4-6]和真菌[7]等大多数真核生物中，并且可能在生命进化的早期阶段就已经出现了[8]，是生物体本身的一种 RNA防御机制。目前，将构建好的沉默载体转入植物体已经成为较为有效的植物抗病毒基因工程方法[9-10]，即通过转录形成双链RNA（dsRNA）诱导RNA沉默来达到抗病毒的目的。

GATEWAY是通过重组交换的基因克隆方法，可以使目标序列通过一次性交换到克隆载体上并形成反向重复序列[11]。本研究根据绒毛状烟草基因组测序获得的8个抗病毒病相关R基因的部分片段序列，采用GATEWAY技术，构建具有反向重复结构的发卡形RNAi表达载体。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 RNA超纯提取试剂盒，PCR产物纯化回收试剂盒，卡那霉素（kanamycin），壮观霉素（奇霉素，spectinomycin）均购自北京全式金生物技术有限公司。RNA反转录试剂盒，Taq DNA聚合酶，MarkerDL500，均为TaKaRa公司产品。

1.1.2 菌株与质粒 克隆的宿主菌E.coli DH5a菌株购自北京全式金生物技术有限公司，DB 3.1菌株由中国农业科学院生物技术研究所惠赠。GATEWAY pDONR201TM载体与pH 7 GWIWG2(I)载体由 CSIRO Plant Industry (http://www.pi.csiro.au/home.htm)惠赠。BP clonaseTMⅡ和LR clonaseTMⅡ为美国Invitrogen公司产品。

1.2 方法

1.2.1 含attB位点的引物设计 将绒毛状烟草全基因组测序获得的580多个抗病相关基因在NCBI网站上进行 blast比对分析、预测其功能，筛选出 8条序列与抗病毒病相关 R基因高度同源，采用primer 5.0引物设计软件对这8条序列设计引物，并分别在设计出的上游引物和下游引物的5′端连接特异性结合位点：attB1和attB2的后12个碱基序列，作为第一次PCR扩增的引物序列（表1）。二次PCR引物为attB1和attB2序列，attB1和attB2的序列分别为attB1：GGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT；attB2：GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT。

1.2.2 抗病毒病相关 R基因 RNAi片段的克隆2010年 12月取普通红花烟草的幼嫩叶片提取RNA，TAKARA反转录试剂盒进行反转录。以含部分attB位点的引物对反转录产物cDNA进行PCR扩增，扩增条件为：94 ℃预变性 5 min，94 ℃变性45 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35个循环；最后72 ℃延伸10 min。将获得的attB-PCR产物稀释10倍后作为模板，以attB1和attB2全长为引物进行二次PCR，扩增条件与第一次PCR相同。将第二次扩增获得attB-PCR产物（两端含有特异性结合位点attB1和attB2的R基因片段）纯化回收，保存备用。

表1 PCR扩增所用引物Table 1 Primers sequences for PCR

1.2.3 相关R基因RNAi载体构建 将GATEWAY pDONRTM201载体与pH 7 GWIWG2(I)载体转入到大肠杆菌DB3.1中进行扩繁增殖，提取质粒保存备用。

RNAi载体构建具体操作步骤如下：

BP反应构建入门载体：用BP ClonaseTMenzyme mix Ⅱ（Invitrogen）催化纯化后的attB-PCR产物和pDONRTM201进行BP反应，反应物在 25℃条件下反应 1 h，然后加入 1 μL的proteinase K 酶（100 μmol/L）溶液在 37 ℃条件下温育10 min。之后吸取1 μL反应物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，在含有 50 mg/L卡那霉素（kanamycin）的LB固体培养基上过夜培养并筛选阳性克隆，挑取单菌落到同样含有50 mg/L卡那霉素（kanamycin）的LB液体培养基中摇菌并提取质粒（入门载体），经PCR鉴定后送交TaKaRa公司测序。

LR反应构建表达载体：用 LR ClonaseTMⅡenzyme mix（Invitrogen）催化入门克隆与表达载体pH 7 GWIWG2(I)进行重组反应，反应条件与BP反应条件类似，25 ℃反应 1 h后，加入 1 μL的proteinase K 酶（100 μmol/L）溶液并在 37 ℃条件下温育10 min终止反应。然后吸取1 μL的反应物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，在含有50 mg/L壮观霉素（spectinomycin）的 LB固体培养基上过夜培养并筛选目的阳性克隆，挑取单菌落到同样含有50 mg/L壮观霉素的LB液体培养基中摇菌并提取质粒（目的载体），经PCR鉴定后保存用于农杆菌转化反应。

2 结 果

2.1 RT-PCR扩增R基因片段

以普通红花烟草cDNA为模板，在高保真Taq DNA聚合酶作用下，经过两次 PCR，扩增出两端携带特异性重组位点attB的相关抗病毒病R基因片段（图1）。根据已知的R基因序列，8个R基因的预期片段大小分别为 216、198、193、246、285、187、300、183 bp。8个R基因的预期片段长度加上两端的特异性结合位点attB各29 bp，和图中得到8个特异性电泳条带的大小相符，说明已经成功扩增到了8个R基因的目标片段。

图1 扩增得到的携带特异性重组位点的8个R基因片段Fig.1 Partial sequence of R genes with specific banding site attB by PCR amplification

2.2 入门载体的检测

对经卡那霉素（kanamycin）筛选得到的入门克隆挑取单菌落后摇菌，提取质粒后以质粒为模板，以attB引物进行PCR检测，得到与attB-PCR产物大小一致的电泳条带，而阴性对照则不能检测出条带（图 2）。测序结果显示，除去测序产物两端的attB序列，中间扩增出的片段与绒毛状烟草基因组测序获得的 R基因片段序列一致，即成功构建了pDONR 201入门载体。

图2 入门载体的PCR鉴定Fig.2 PCR detection of entry vectors

2.3 表达载体的检测

在含有壮观霉素（spectinomycin）的培养基上筛选得到阳性克隆，以提取到的目的载体为模板加入attB引物进行PCR检测，同样得到与attB-PCR产物大小一致的电泳条带（图3）。对PCR产物测序结果显示，PCR产物序列与绒毛状烟草基因组测序获得的R基因片段序列一致，说明成功构建了R基因RNAi的表达载体。

图3 表达载体的PCR鉴定Fig.3 PCR detection of expression vectors

3 讨 论

RNAi技术是近几年生命科学界的热点之一，美国Science杂志曾2年将其评选为年度十大突破技术。RNAi机制的进一步阐明，为深入了解植物与病毒之间的互作关系提供了有力的理论依据，也为科技工作者在培育抗病毒品种方面提供一条简捷、高效的技术手段。随着烟草基因组测序工作的完成以及许多农作物ESP资料库的建立，为利用反向遗传学研究基因功能奠定了坚实的基础，同时也为RNAi技术提供了更大的发展空间。只要将某个植物R基因或病毒基因的片段通过载体或者病毒转入目标植株或宿主体内，就可以使目标植株或宿主的同源基因发生降解而沉默，利用该方法可以在较短时间内鉴定出大量基因的功能。将GATEWAY技术应用到可以大规模筛选基因功能的 RNAi原理中，避免了传统克隆技术中限制性酶切和连接的过程，使基因转入到目标载体的过程更加简捷、实用，为从反向遗传学的角度研究基因功能提供了技术支持和理论指导。

关于几种不同 RNA干扰载体构建获得基因表达受抑制转基因植株的比例，Wesley等[12]经过评价认为，两个反向重复序列中间含有一个内含子所形成的ihpRNA结构的RNA干扰载体沉默效果最好，效率平均高达90%以上。本研究使用GATEWAY的载体 pH 7 GWIWG2(I)具有两对方向完全相反的attR结合位点，两对attR结合位点中间有一段1 047 bp大小的内含子片段，这样的结构保证了基因片段可以按照完全相反的方向插入目的载体，并且在转录后形成发卡 RNA结构（hpRNA）。此外，pH 7 GWIWG2(I)载体中ccdB是致死基因，只有目标基因完全取代两个 ccdB在目的载体中的位置，转化菌才能存活，以上两种机制保证了LR反应得到的表达载体的准确性。RNA干扰技术中，在干涉片段的选择上具有很大的可塑性，一般认为从 90～1800 bp之间[13]。本研究中扩增的8个R基因序列长度从183 bp到285 bp不等（不包含两端各29 bp的attB序列），这样大小的干扰片段既可以保证转基因植株的沉默效果，也避免了载体外源片段过大时构建载体的难度，同时对遗传转化和外源基因在转基因植株中的稳定遗传都是有利的。关于绒毛状烟草基因组测序获得抗病毒病相关R基因的具体功能，将在利用该沉默载体进行遗传转化之后进一步分析研究。

[1]Herve Vaucheret, Christophe Beclin, Mathilde Fagard.Post-transcriptional gene silencing in plants [J].Journal of Cell Science 2001, 114(17): 3083-3091.

[2]Cogni C, Irelan J, Schumacher M, et al.Transgene silencing of the al-l gene in vegetative cells of Neurospora is mediated by a cytoplasmic effector and does not depend on DNA-DNA interactions or DNA methylation [J].EMBO J, 1996, 15(12):3153-3163.

[3]Waterhouse P M, Graham M W, WANG M B.Virus resistance and gene silencing in plants can be induced by simultaneous expression of sense and anti-sense RNA [J].BMC Plant Biology, 1998, 95 (23): 13959-13964.

[4]Lohmann J U, End I , Bosch T C G.Silencing of developmental genes in Hydra [J].Developmental Biology, 1999, 214(1): 211-214.

[5]Wargelins A, Ellingsen S, Fjose A.Double-stranded RNA induces specific developmetal defects in zebrafish embryos [J].Biochemical and Biophysical Research Communication, 1999, 263(1): 156-161.

[6]Wianny F, Zernicka-Goetz M.Specific interference with gene function by double-stranded RNA in early mouse development [J].Nature Cell Biology, 2000, 2(2): 70-75.

[7]Cogni C, Macino G.Gene silencing in Neurospora crassa requires a protein homologous to RNA-dependent RNA polymerase [J].Nature, 1999, 399: 166-169.

[8]Sharp P A.RNA interference-2001 [J].Genes Development, 2001, 15(5): 485-490.

[9]Tenno T, Goda N, Tateishi Y, et al.High-throughput construction method for expression vector of peptides for NMR study suited for isotopic labeling [J].Protein Engineering Design Selection, 2004, 17 (4) : 305-314.

[10]Ohsugi T, Kumasaka T, Urano T.Construction of a full-length human T cell leukemia virus type I genome from MT-2 cells containing multiple defective proviruses using overlap in polymerase chain reaction [J].Analytical Biochemistry, 2004, 329 (2): 281-288.

[11]牛颜冰，青玲，周雪平.RNA沉默机制及其抗病毒应用[J].热带作物学报，2009，30（4）：505-508.

[12]Wesley S V, Helliwell C A, Smith N A, et al.Construct design for efficient, effective and high- throughput gene silencing in plants [J].The Plant Journal, 2001, 27 (6):581-590.

[13]Sayaka H, Shin-ichiro O, Eri A, et al.The effects of spacer sequences on silencing efficiency of plant RNAi vectors [J].Plant Cell Reports, 2007, 26 (5): 651-659.