利用荧光MFLP标记技术分析烟草种质的遗传多样性

何其芳，李荣华，郭培国*，宁正祥，邱妙文，赵伟才，陈俊标，夏岩石，白 盼

（1.广州大学植物抗逆基因功能研究广州市重点研究室，生命科学学院，广州 510006；2.华南理工大学轻工与食品学院，广州 510640；3.广东省烟草公司南雄科学研究所，广东 南雄 512400；4.广东省农科院作物研究所，广州 510642）

微卫星锚定片段长度多态性（ Microsatellite-anchored fragment length polymorphism, MFLP）是2001年由Yang等[1]利用AFLP和SSR锚定引物技术的双重原理创立了一种新型的分子标记技术，其实质是同时探查限制性内切酶酶切位点和限制性片段内碱基序列、微卫星重复基元的变异，具有AFLP多态性丰富和具有SSR共显性等优点[2]。另外，MFLP多态性不需经过冗长繁琐的实验过程，就能转化获得序列特异性的SSR或PCR标记[1,3]。利用该技术，分析了多种作物的生物多样性、构建了遗传连锁图、并发现了与抗病性和品质相关的MFLP标记[1,3-5]。

烟草是重要经济作物之一，但在利用分子标记技术方面，与其他作物相比，仍有较大差距。主要体现在大量研究主要利用稳定性和重复性较差的RAPD技术[6-7]，近来有报道利用AFLP技术开展烟草材料的遗传多样性分析[8-9]；而烟草 SSR标记技术的研究起步晚，直到2007年Bindler等[10]首次报道如何开发烟草的SSR标记，并利用开发出的282个 SSR标记构建了遗传连锁图谱。随后利用这些SSR标记，分析了烟草品种的多样性及进化关系等[11-13]，但在种质遗传多态性分析实验中发现这些SSR在烤烟上只有20个能扩增出具有明显SSR特性（如共显性）的扩增条带[13]。直到现在还未见利用MFLP技术开展烟草遗传特性分析方面的研究报道。另外，MFLP技术均采用放射性同位素进行标记[1,4-5]，该技术存在着一系列令人困扰的问题，通常在普通实验室中难以开展，如果能将荧光标记技术成功运用到MFLP中将能够大大提高实验的安全性并降低实验成本，更加有利于MFLP技术的发展。

本研究以 32份烟草种质为材料，利用我们建立的烟草MFLP荧光标记分析体系，将M13通用荧光接头连接在设计的 SSR锚定引物上对扩增产物进行荧光标记，并对烟草种质材料进行多态性分析，为荧光MFLP技术在烟草遗传多样性及其他遗传特性分析的研究和应用提供技术基础。

1 材料与方法

1.1 烟草种质材料及基因组DNA的提取

本试验选用的 32份烟草种质材料由广东省农科院作物所提供，种质材料的序号、名称、来源和类型如表1所示。2010年盆栽种植烟草各材料，在幼苗期采收叶片，按李荣华等[14]改良的CTAB法，提取各材料的基因组DNA，并将提取的烟草DNA浓度稀释到100 ng/μL后作为MFLP的模板。

表1 烟草种质材料及来源Table 1 Tobacco germplasm and origins

1.2 引物和试剂

荧 光 引 物 M13-F-IRDye 700（5′-CACGACGTTGTAAAACGAC-3′）购自美国LICOR公司，SSR锚定引物、带M13接头的SSR锚定引物（即加尾 SSR锚定引物）、MseI接头和MseI引物、实验所需的酶及试剂均购自上海生物工程有限公司合成。MFLP中使用的引物信息见表2。

表2 MFLP预扩增和选择性扩增的引物Table 2 MFLP primers used in pre- and selective-amplification

1.3 荧光MFLP标记技术

依据Yang等[1]MFLP技术的原理，结合荧光标记技术，建立了烟草荧光MFLP标记技术，具体过程如下：

1.3.1 酶切和连接 取MseI adapter-1（100 pM）和MseI adapter-2（100 pM）各 62 μL，混均后在 95 ℃水浴5 min，取出后放在操作台上冷却20 min，作为MseI adapter备用。MseI酶切反应液总体积为30 μL，包括 DNA（100 ng/μL）3.0 μL，MseI酶（10 U/μL）0.6 μL，10×buffer R 3.0 μL，双蒸水 23.4 μL，在 37℃条件下酶切2 h，之后在80 ℃条件下保温20 min终止反应；之后在MseI酶切产物中加入MseI adapter 1 μL，10×ligase buffer 2 μL，T4 DNA 连接酶(5 U/μL) 0.2 μL，双蒸水 6.8 μL，在 20℃条件下反应5 h，在65℃条件下保温10 min终止反应，此液为连接后产物。随后取 10 μL连接产物，2 μL 10×buffer R，2 μLHaeIII酶（10 U/μL），12 μL 双蒸水，37℃条件下再次酶切 3 h，酶切后产物加入80 μL TE0.1（10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA pH 8），作为预扩增反应的DNA模板。

1.3.2 预扩增 预扩增PCR反应体积为30 μL，含预扩增模板 6 μL，Taq DNA Polymerase（5 U/μL）0.45 μL，SSR 锚定引物（10 μM）1.5 μL，MseI引物（10 μM）1.5 μL，10×PCR buffer 3.0 µL，Mg2+（20 mM）3.6 µL，10 mM dNTP 0.9 μL，双蒸水13.05 μL。PCR反应程序如下：94 ℃预变性2 min，25个PCR循环（94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min）。预扩增产物用TE0.1稀释10倍后即是选择性扩增的DNA模板。

1.3.3 选择性扩增及检测 选择性扩增的 PCR反应体积为10 μL，含选择性扩增模板1 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.15 μL，加尾 SSR 锚定引物（1 μM）0.6 μL，10×PCR buffer 1.0 µL，Mg2+（20 mM）1.2µL，10 mM dNTP 0.3 μL，荧光引物 M13-F（0.1 μM）0.5 μL，MseI选择性扩增引物0.6 μL，双蒸水4.65 μL。选择性扩增的 PCR 程序如下：94 ℃ 30 s、60 ℃（每个循环下降0.7 ℃）30 s、72 ℃ 1 min，循环9次；再按 94 ℃ 30 s、54 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min 循环25次。扩增产物利用LI-COR 4300 DNA遗传分析仪（LI-COR Biosciences, USA）进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳扫描检测。

1.4 数据统计及分析方法

依据荧光扫描图谱的结果，用“1”（有）和“0”（无）记录谱带，把图形资料转换成数据资料。利用NTSYS2.0e软件，以除权配对法（UPGMA）[15]进行SAHN聚类分析和主坐标分析，并计算出样本间的遗传相似系数。

2 结 果

2.1 选择性扩增引物对的筛选与烟草种质材料的MFLP多态性分析

利用 D101、RG17、长脖黄和 C151作材料，分析MFLP选择性扩增引物组合的扩增效果来确定适宜的引物组合。试验结果发现，5个加尾SSR锚定引物（fGTCC(GA)6、fCCCA(AG)7、fGGCT(AAG)5、fGACG(AAC)5和fCCAG(CTT)5）分别与 16种MseI选择性扩增引物组合后扩增出60～700 bp之间荧光强度强弱不一的条带；但有些引物组合的扩增条带大多集中在低分子量部分，有的引物组合扩增出的条带虽多但在4个种质材料间没有发现多态性。经过比较分析后发现，15对引物组合（表3）的扩增产物在4个种质材料间具有明显多态斑且清晰易辨，这 15个选择性引物组合将用于烟草种质材料的MFLP分析。

利用筛选出的选择性扩增引物组合分析 32份烟草种质，共扩增出1 122个条带，其中有64个具多态性（表3），多态性占总扩增带数的5.7%，表明参试资源的遗传多样性不是非常明显。其中每个组合可以得到2～13个清晰易辨的多态性条带（图1），表明不同引物组合的扩增效率差异很大。另外，不同来源、类型烟草材料间存在的多态性数目和比例差异相对较大。巴西晒晾烟扩增出 46条多态性带，多态性比例为4.1%；革杂基扩增出34条多态性带，多态性比例为 3.0%；其他来源的参试资源的相关数据介于二者之间。这些多态性主要分布在80～400 bp。

表3 筛选出的选择性扩增引物组合及其扩增片段具有的多态性Table 3 MFLP fragments and polymorphic bands detected from each selective primer combinations

图1 烟草种质材料的一个MFLP电泳图Fig.1 An MFLP gel showing polymorphic bands among 32 tobacco varieties.

2.2 烟草种质材料的聚类分析

32份烟草种质两两间的相似系数在 0.40到0.83之间，其中D101（美国烤烟）和革新六号（山东烤烟）之间最小，相似系数才0.40，RG17（美国烤烟）和CO139（美国烤烟）之间的相似系数最大，为0.83。根据遗传相似系数，用非加权组平均法如图2。从图中可看出，取相似系数为0.60进行第1等级划分，可将32份烟草材料分成5大类。C212、NC60和金星均各成一大类。第4大类的平均相似系数约为0.62，它在相似系数约为0.68处又可以分成3小组，第1组包括D101、RG17、长脖黄、C151、CO139、CO176、K149、K326、革杂基和翠碧一号，全部都是烤烟，其中6个来自美国，其他都来自中国，其中RG17和CO139的相似系数最大，种质间的亲缘关系最近；第2组包括G28、K358、K399、K730、OX2028、R-158、RG11、RG-22和RG-8均是美国烤烟，其中，K730和OX2028的亲缘关系最近；第3组包括CV087和NC95。第5大类的平均相似系数也约为0.62，它在0.68处也可以分成3小组，第1组包括K346和丰字一号，第2组是KY26、巴西晒晾烟和大白筋599，第3组是Atnarello毛晾、革新六号和红花大金元。

图2 32份烟草种质材料的基于MFLP多态性数据转化成遗传多态性的UPGMA聚类图Fig.2 UPGMA dendrogram depicting patterns of genetic diversity estimated by MFLP marker alleles among 32 tobacco varieties

从以上的聚类结果来看，大部分来自美国的烤烟品种很好地聚类到了一起，3个白肋烟都包含在第5大类之中，但总体而言并没有明显地分辨出白肋烟和烤烟的区别，反而是来自广东的烤烟C212、美国的烤烟NC60和山东的烤烟金星和其他品种的亲缘关系较远，其遗传差异性较大。

2.3 依据MFLP标记的32份烟草种质的主坐标分析

对32份烟草种质的MFLP标记的原始矩阵进行主坐标分析，前3个主坐标所能解释的相关性分别为12.4%、10.6%和8.3%。32份种质的第1和第2主坐标、第1和第3主坐标的二维图排序如图3所示。

图3 依据MFLP标记对烟草种质进行主坐标分析的第1与第2（左）、第1与第3（右）主座标散点图Fig.3 Principal coordinate map for the first and second (left ), the first and third (right) coordinates estimated for MFLP marker alleles by means of the genetic similarity matrix for 32 tobacco varieties

综合第1和第2座标及第1和第3座标排序，可将烟草种质材料分成4类11个组。第1类共有3个白肋烟5个烤烟，分成3组；第1组包括KY26、革杂基、大白筋599，第2组包括K346、Atnarello毛晾、巴西晒晾烟，第3组为翠碧一号和丰字一号。第2类的9个烤烟可分成3组，第1组包括D101、CO139、CO176、K326、长脖黄和C151，第2组为RG17和RG-22，第3组为K149。第3类的9个烤烟材料亦分成3组，其中第1组为CV087和NC95，第2组为K399，第3组全来自美国的烤烟，包括G28、K730、NC60、OX2028、RG11、RG-8。第 4类则分成2组，第1组为K358，第2组包括C212、R-158、革新六号、红花大金元和金星。

主坐标分析能从不同方向、不同层面更加直观地显示各品种间的关系，可进行更加细致精确的归类。在以往的亲缘关系研究中，多采用系统聚类法，这对于反映亲缘关系很近的种质之间的关系来说很有效，但对于亲缘关系较远的种质之间的聚类，却显得信息量不足。因此，将系统聚类分析和主坐标分析结合起来使用，相互补充、验证，能为阐明烟草种质之间的亲缘关系提供更全面的信息[16]。

3 讨 论

3.1 荧光标记技术

Yang等[1]建立的MFLP分析技术采用放射性同位素进行标记，但存在着一系列令人困扰的问题，如成本高、探针半衰期短、放射性物质危害人体健康等；另外还需要有专门的实验室、相应的实验保护设施和专业人员，因而限制了在普通实验室开展研究工作，而采用荧光标记技术则不存在上述问题。因此，本研究通过将M13通用荧光接头连接在设计的SSR引物上，对操作者而言安全系数高。另外，与国内较常用的银染相比，荧光标记的效率明显高于银染，能得到更多更全的基因组变异信息，所花时间也短，而且从总体上而言，在不讨论设备成本的前提下，荧光标记的总成本会低于银染[17]。

3.2 烟草品种的遗传多样性

根据本试验聚类分析和主坐标分析结果，难以完全确定来自不同国家和地区的烟草品种材料，只是当类分得很细时可将一部分美国烤烟品种单独组成一组（主坐标分析中第3类的第3组），这表明供试烟草品种的地理来源与遗传差异之间并没有必然的联系，当然也有一部分原因是国内许多品种来源于美国品种，因此亲缘关系较近。3个白肋烟品种也没有与其他烤烟品种表现出很明显的区别，只是表现出三者之间的亲缘关系相对较近，且均聚集在一个大类中（聚类分析中均在第 5大类中），在一定程度上预示了两大品种间应该还是存在一定的差异。本研究从分子水平上一定程度地印证了目前我国烟草品种资源的匮乏，且实验结果与肖炳光等[18]的报道类似，均未体现出地域性差异对聚类结果有明显的影响。因此，在今后的烟草育种中应该更多地考虑被聚集在不同类中的烟草资源，而不是单纯地考虑其来源地。

3.3 MFLP分子标记在烟草遗传分析中的应用分析

但迄今为止，烟草上运用较多且较为成熟的分子标记技术还是RAPD标记，其他标记类型则运用较少；而RAPD标记最大的缺点是引物为单链且短，对反应条件较为敏感，重复性差[19]。简单序列重复区间扩增多态性（ISSR）扩增产物的重复性和稳定性亦不很理想，扩增效果类似于或略高于RAPD[20]；AFLP技术的重现性和稳定性较高，多态性丰富，适合于作物的遗传分析[8,21-22]，但它与RAPD、ISSR等标记一样，扩增产物基本上都具有多个位点的显性标记，并且难以将其中感兴趣的位点转换成序列特异性且操作简便的PCR标记[1,22]。SSR标记操作简便，稳定性、重现性好，共显性、序列特异性强，但烟草中发现SSR的数量仍限于Bindler等[10]开发的282个烟草的SSR标记，明显难以满足开展烟草研究和应用的需要。而MFLP技术最大的优点是结合了SSR和AFLP标记的优点，具有多态性丰富、重复性和稳定性好、且有高比例共显性等优点，并且很容易将具多态性的MFLP片段转换成序列特异性且操作简单的PCR标记（主要是SSR标记）[1,3]；这样运用MFLP技术开展烟草遗传分析的同时，还可开发具有多态性的烟草SSR标记。因此，本实验荧光MFLP技术在烟草遗传分析成功应用，不仅能为烟草种质材料的分类提供更多依据，还可为开发出烟草的序列特异性PCR标记、促进烟草DNA分子标记技术的发展奠定基础。

4 结 论

在 Yang等 2001年建立的利用放射性同位素MFLP分子标记技术的基础上，我们建立了适合于烟草的荧光MFLP分子标记技术体系。利用此体系检测了32份烟草种质材料的MFLP多态性，所得的烟草MFLP荧光图谱的条带清晰易辨且多态性丰富，结合聚类分析能有效地将这些烟草种质材料的来源和类型进行分类，表明荧光MFLP技术可较好地用于开展烟草遗传特性分析的研究和应用工作。

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