硫酸黏菌素对小鼠坐骨-胫神经毒性作用的电生理表现

代重山，李继昌，林巍，王凤霞，孙美成，李健

(1.东北农业大学动物医学学院，黑龙江哈尔滨150030;2.Facility for Anti-infective Drug Development and Innovation，Monash Institute of Pharmaceutical Sciences Monash University，Victoria 3052，Australia)

硫酸黏菌素对小鼠坐骨-胫神经毒性作用的电生理表现

代重山1，李继昌1，林巍1，王凤霞1，孙美成1，李健2

(1.东北农业大学动物医学学院，黑龙江哈尔滨150030;2.Facility for Anti-infective Drug Development and Innovation，Monash Institute of Pharmaceutical Sciences Monash University，Victoria 3052，Australia)

目的探讨硫酸黏菌素对小鼠坐骨-胫神经的毒性作用。方法昆明系雌性小鼠尾静脉注射硫酸黏菌素7.5 mg·kg－1，每12 h 1次，按取材时间分为给药1，3，7 d组及给药7 d停药7 d组。分别于第2和第4天给药前、第8和第15天(以第1次给药当天为第1天计)观测小鼠的体质量、步态、后肢支撑力、坐骨-胫神经的复合动作电位阈强度(TI)、最大刺激强度(MI)、潜伏期(CAPL)、波幅(CAPA)、时程(CAPD)、传导速率(NCV)以及血清肌酐(Cre)、尿素氮(BUN)的变化情况。结果与正常对照组相比，硫酸黏菌素给药1 d组，血清Cre显著升高，给药3 d组，体质量及BUN出现显著性差异，给药7 d组，步态、后肢支撑力出现显著性差异。给药1，3和7 d组，坐骨-胫神经动作电位各参数随时间发生改变，TI显著增加，分别为60%，60%，193%(P＜0.01);MI显著增加，分别为4%，13%和100%(P＜0.05);CAPL显著增加，分别为9.0%，9.0%和14.6%(P＜0.05)，CAPA降低，分别为0.92%，16.2%和47.6%(P＜0.01);CAPD显著增加，分别为15.1%，11.5%和52.8%(P＜0.05);NCV显著减低，分别为7.6%，7.5%和12.7%(P＜0.05);停药7 d组，步态及后肢支撑力较正常对照组无明显差异，电生理各参数均有所恢复，且只有CAPA较正常对照组差异显著(P＜0.05)。结论硫酸黏菌素肾毒性较神经毒性先发生，小鼠坐骨-胫神经动作电位随给药时间延长发生进行性变化，且CAPA持续时间最长。

硫酸黏杆菌素;坐骨-胫神经;神经毒性

黏杆菌素(colistin)，也称多黏菌素E，于1949年首次发现，由多黏芽孢杆菌黏菌素亚种(Bacillus polymyxa subsp.colistinus Koyama)代谢产生的碱性多肽类抗生素［1］。临床上主要有甲磺酸钠黏菌素和硫酸黏菌素两种类型，其中硫酸黏菌素杀菌作用较强，但毒性作用较甲磺酸钠黏菌素大［2］。20世纪70年代末，因神经毒性及肾毒性仅允许用于多药耐药(multidrug-resistant，MDR)革兰阴性细菌感染的纤维囊性肺炎重症的治疗［3］。近年来，由于世界范围内MDR革兰阴性菌株的出现，特别是鲍曼不动杆菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯菌的MDR的蔓延，已成为临床治疗的棘手问题，甚至引起爆发性播散感染，导致较高的死亡率，而新的抗生素的短缺，使得已被弃用20余年的黏菌素被重新评估和使用［4］。Lim等［5］预测，在未来5年，黏菌素将是临床治疗MDR革兰阴性细菌感染的最佳选择，也是最后的防线。

有关黏菌素的肾毒性机制研究较多，但其神经毒性是由中枢神经系统介导还是周围神经系统介导尚不清楚［6］。动物实验及临床研究发现，黏菌素可引起动物或人四肢麻木、四肢无力、下肢疼痛、感觉异常、多发性周围神经炎，表明黏菌素可能直接或间接地对周围神经造成影响及损伤［7－10］。因此，本研究通过神经电生理手段评价硫酸黏菌素对小鼠的周围神经毒性作用，分析坐骨神经电生理变化与黏菌素神经毒性作用之间的关系，为黏菌素神经毒性的机制研究及临床神经毒性的早期诊断提供依据。

1 材料与方法

1.1 药品和仪器

硫酸黏菌素原粉，美国Sigma公司产品，1 mg相当于20 195黏菌素单位;BL-420E生物机能实验系统，成都泰盟科技有限公司生产;756P紫外可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司生产;TGL-16C台式离心机，上海安亭科学仪器厂生产;肌酐(creatinine，Cre)检测试剂盒(批号:20110317)，尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)检测试剂盒(批号:20110318)，均购自南京建成生物研究所;戊巴比妥钠，德国生产，北京生化试剂公司分装(批号:20101214)。

1.2 动物、分组和给药

健康雄性昆明系雌性小鼠80只，体质量18～22 g，购于中国农科院哈尔滨兽医研究所实验动物中心，许可证号:黑B2-20070878。常规颗粒饲料饲养，自由饮水，温度控制在20～24℃，湿度40%～60%，适应性饲养1周。实验分为正常对照和硫酸黏菌素处理两大组，每大组按照检测时间分为给药1，3，7 d和给药7 d停药7 d组。硫酸黏菌素临床推荐剂量为1.5～3 mg·kg－1·d－1，分2～4次完成给药，且用药时间标准不一，通常为3～28 d［11－12］，按体质量50 kg计算，小鼠的使用剂量应该为每天15～30 mg·kg－1，本文据此推算小鼠的剂量范围，并依据前期预实验，确定实验组小鼠单次尾静脉注射黏菌素7.5 mg·kg－1(10 ml·kg－1)，每12 h 1次，连续给药7 d，正常对照组以同种方式注射生理盐水。以给药当天为第1天，每大组分别按照第2天和第4天给药前、第8和第15天时间点进行指标检测，每个时间点9～10只。

1.3 一般毒性观察

每天给药前及给药后观察小鼠精神状态，毛发光泽度，饮食情况，活动情况并记录。

1.4 步态评分［13］

将小鼠放在空旷的地面上，使其自主行动，观察3 min。1分:正常步态;2分:轻微异常步态(轻微的共济失调，足张开，行动吃力);3分:中度异常步态(明显的共济失调，足张开，移动时肢外展);4分:重度异常步态(足张开，不能支持身体质量，无法站立)。每组评分结果以平均值表示。

1.5 后肢支撑力变化［14］

使小鼠从距地面15 cm处自由落下，准确测量着地时其后肢爪尖滑开的最远距离。每只测试3次，每次间隔30 min，取平均值。

1.6 坐骨-胫神经电生理指标测定

实验过程中，控制室温在23～27℃，ip给予0.4%戊巴比妥钠40 mg·kg－1麻醉小鼠，使用加热灯控制小鼠体温。暴露小鼠左后肢坐骨神经干，覆盖温热石蜡油，并连接钩状刺激电极，记录针电极连接脚踝及小鼠第1趾间肌肉。接地电极连接刺激电极与记录电极之间的皮肤上。所有神经电项目在30 min内完成。

1.6.1 神经干阈刺激强度(threshold intensity，TI)和最大刺激强度(maximal intensity，MI)的测定

采用BL-420E生物机能实验系统软件“肌肉神经实验”中“阈强度与动作电位关系”模块。刺激条件:延时1 ms，波宽0.1 ms，频率10 Hz，初始值0 V，程控，刺激间隔1.0 s，增量25 mV。记录条件:时间常数0.01 s，高频滤波10 kHz。刚开始出现动作电位波形时的刺激强度为TI;动作电位波形达到最大时所对应的刺激电位即为MI。

1.6.2 神经干动作电位的测定

采用BL-420E生物机能实验系统软件“肌肉神经实验”中“神经干动作电位的引导”模块，刺激条件:延时1 ms，波宽0.1 ms，频率10 Hz。记录条件:增益200倍，时间常数0.01 s，高频滤波10 kHz。以超过最大刺激强度25%的刺激为刺激强度。在引导出的双相动作电位上，复合动作电位波幅(compound action potential amplitude，CAPA)为波峰波谷的高度差，复合动作电位时程(compound action potential duration，CAPD)为波长，复合动作电位潜伏期(latency of compound action potential，CAPL)为刺激伪迹起始部与动作电位起始部之间的距离。

1.6.3 运动神经传导速度(nerve conduction velocity，NCV)的测定

采用BL-420E生物机能实验系统软件“肌肉神经实验”中“神经干兴奋传导速度测定”模块，刺激及记录条件同动作电位的测定。将动物后足以自然肢体状态与脊柱成45°夹角向斜后方拉直，沿坐骨神经经过部位和方向，在动物体表准确测定刺激电极到记录电极之间的距离(s)，潜伏期为刺激伪迹起始部至动作电位起始部之间的时间(t)根据v=s/t，计算NCV。

1.7 血清肌酐及尿素氮含量的测定

电生理指标检测完成后，对小鼠摘眼球取血，3000×g离心10 min，取血清置4℃冰箱备用。血清Cre及BUN含量的测定:按试剂盒说明进行。

1.8 统计学分析

步态评分、后肢支撑力、电生理各参数各时间点的正常对照组数据变化不大，为了便于计算和统计，取平均值作为正常对照组数值，数据结果用±s表示。对小鼠体质量变化进行t检验，具体使用SPSS11.5 one-way ANOVA统计分析，并进行齐次性检验，当方差齐次时，使用LSD多重比较，当方差不齐次时，使用Dunnett T3检验。P＜0.05表示差异显著，P＜0.01为差异极显著。

2 结果

2.1 黏菌素对小鼠的一般毒性作用

小鼠每次给药后表现出兴奋不安，随后逐渐呆滞不动，此后腹式呼吸明显，约10 min后呼吸基本恢复正常。在第4天第1次给药后，1只小鼠出现严重的抽搐，伏地不起，后缓慢恢复。从给药后第4天起，大部分黏菌素组小鼠表现出精神抑郁，活动减少，后肢无力，停药3 d后，部分小鼠精神状态逐渐开始恢复，停药7 d时仍然有少数小鼠表现为精神抑郁，后肢无力。

2.2 黏菌素对小鼠体质量的影响

正常对照组小鼠体质量在15 d内持续稳定地增长，黏菌素组小鼠体质量的增长速度明显低于正常对照组，给药3 d后开始出现显著性差异，较正常对照组下降了9.3%(P＜0.05)，给药7 d和停药7 d后体质量分别下降了12.5%和11.3%(P＜0.01)(图1)。

Fig.1 Effect of colistin sulphate on mouse body mass.Colistin sulphate 7.5 mg·kg－1was given iv，twice a day for 7 d and withdrawal 7 d.The measurement was taken while colistin sulphates were given for 1，3 and 7 d，and 7 d post administration.d 0:before drug.±s，n=9－10.*P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with corresponding normal control group.

2.3 黏菌素对小鼠步态的影响

与正常对照组步态评分1.0±0.0相比，给药1和3 d组小鼠步态评分别为1.2±0.4，1.2±0.4，无明显差异。给药7 d组，步态评分为1.8±0.6，较正常对照组差异显著增加(P＜0.05)，药后7 d组步态评分为1.4±0.5，与正常对照组无明显差异。所有步态异常的小鼠，仅有1只在给药7 d后出现明显的共济失调，表现为足展开和移动时肢外展，剩余均为轻度的步态异常。

2.4 黏菌素对小鼠后肢展开距离变化

与正常对照组后肢展开距离(3.5±0.1)cm相比，给药1和3 d组小鼠后肢展开距离别为3.6±0.1和(3.5±0.1)cm，无明显差异。给药7 d组小鼠，步态展开距离为(3.7±0.1)cm，较正常对照组差异显著增加(P＜0.05);药后7 d组小鼠后肢展开距离(3.6±0.1)cm，与正常对照组无明显差异。

2.5 黏菌素对小鼠坐骨神经-胫神经电生理的影响

2.5.1 波形

正常对照组波形正常，给药1 d组，2只小鼠坐骨神经-胫神经出现重复性动作电位，给药3及7 d组，波形与对照组有所不同，出现三相动作电位，但未见重复性动作电位(图2)。

Fig.2 Representative record of compound action potential(CAP)of sciatic-tibial nerves in mice treated with intravenous colistin sulphate.The mice were iv given colistin sulphate 7.5 mg·kg－1，twice a day for 1，3 and 7 d and grouped as colistin sulphate 1，3 and 7 d group，respectively.The mice of 7 d post colistin sulphate group were given colistin sulphate 7.5 mg·kg－1for 7 d and withdrawal 7 d.A:normal group;B，C，D and E:colistin sulphate 1，3，7 d and 7 d post colistin sulphate groups，respectively.

2.5.2 TI和MI

与正常对照组相比，给药1，3，7 d及药后7 d组小鼠TI参数呈逐渐增加趋势，并且只有给药7 d组为明显增加，分别增加了60%，60%，192%(P＜0.01)和70%，MI分别增加了4%，13%，100%(P＜0.05)和29%(表1)。

2.5.3 CAPA，CAPL，CAPD和NCV

与正常对照组相比，给药1，3，7 d及药后7 d组，CAPA分别下降了0.9%，16.2%，47.6%(P＜0.01)和38.8%(P＜0.05)(图2);CAPL分别增加了9.0%，9.0%，14.6%(P＜0.05)和11.2%;CAPD分别增加了15.1%，11.5%，52.8%(P＜0.05)和20.6%;NCV分别降低了7.6%，7.5%，12.7%(P＜0.05)和9.3%(表1，图2)。

2.6 黏菌素对小鼠血清Cre和BUN浓度的影响

如表2所示，给药1，3，7 d组和药后7 d组，小鼠血清Cre均较正常对照组显著升高(P＜0.05);BUN从给药3 d开始明显升高(P＜0.01)，药后7 d组略高于正常对照组，但无统计学差异。

Tab.1 Effect of intravenous colistin sulphate on mouse sciatic-tibial nerve electrophysiological indexes

Tab.2 Effect of colistin sulphate on creatinine(Cre)and blood urea nitrogen(BUN)of mice

3 讨论

本实验在临床等效推荐剂量范围内，对小鼠尾静脉注射黏菌素，在给药1 d，3 d，7 d及停药后7 d后，对小鼠肾功能及神经电生理、行为学指标进行测定。小鼠初次给药后表现出一定的急性毒性症状，与Xiao等［9］研究结果相似。小鼠步态评分趋势、呼吸症状随着给药天数的增加而逐渐加重，在给药7 d后较对照组差异显著，可能与黏菌素在小鼠体内的剂量累积及时间依赖性相关［4］。黏菌素在给药3 d后发生明显的肾毒性，并致使小鼠体质量下降，并且可导致小鼠体内的代谢障碍，在随后4 d的给药中，使得黏菌素在体内进一步的累积，致使在给药7 d后，电生理参数及行为学出现异常变化［4，12，15－17］。停药7 d后，小鼠毒性症状有所缓和，行为学指标较对照组均无明显变化，血清Cre及BUN变化也有所恢复，神经电生理参数除CAPA与对照组相比差异显著，其他参数与对照组相比均无显著变化，可能与神经组织的自我修复相关［4，9］，与Wahby等［10］报道相似，即黏菌素发生神经中毒后停药5 d对患者进行神经电生理检测发现，患者肌肉CAPA显著降低，而尺神经CAPA也有所降低。

研究表明［18］，周围神经系统不像中枢神经系统那样有着血脑屏障的保护，因而更易产生毒性反应。Bosso等［19］研究发现，静脉注射黏菌素每天5.8～8 mg·kg－1后，29%的患者发生感觉异常、共济失调。本研究结果表明，坐骨-胫神经动作电位各个参数随时间延长发生进行性变化。NCV的减慢和CAPL的延长可能与神经脱髓鞘相关，CAPA可反映刺激触发轴突的数量或神经纤维的密度，而低CAPA的存在提示了周围神经轴突的损害或丧失，TI及MI的增大也能在一定程度上反映出神经纤维的损伤［20］。在小鼠给药7 d后，CAPA及MI变化程度最为明显，说明黏菌素可能对轴突及小纤维的损伤较为严重。一般认为，黏菌素诱发神经毒性，可能与脂质A基团模式结构，并携带游离阳离子氨基酸，可与高脂质含量神经元相互作用［8］。神经髓鞘的膜性结构含有大量的不饱和脂肪酸，黏菌素可能与其相会作用，致使脂质过氧化损伤，使髓鞘不完整或缺失、轴突直径发生变化，从而导致膜电容和阻抗改变，并使NCV减慢或CAPA降低;或者影响Na+，K+离子通道，致使电生理参数的变化［21］。此外，在小鼠给药1 d后，部分小鼠出现重复性动作电位，可能与临床多发性神经炎相关，但在随后的神经电生理未见此类现象，有待进一步的证实。

本研究表明，黏菌素诱发肾毒性先于神经毒性，对周围神经造成一定的损伤，坐骨-胫神经电生理发生时效性变化，可为黏菌素的神经毒性的机制研究提供一定的依据。

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Electrophysiological changes for toxic effect of colistin sulphate on sciatic-tibial nerves in mice

DAI Chong-shan1，LI Ji-chang1，LIN Wei1，WANG Feng-xia1，SUN Mei-cheng1，LI Jian2
(1.College of Veterinary Medicine，Northeast Agricultural University，Harbin150030，China;2.Facility for Anti-infective Drug Development and Innovation，Monash Institute of Pharmaceutical Sciences Monash University，Victoria3052，Australia)

OBJECTIVETo investigate the toxic actions of colistin sulphate on sciatic-tibial nerves of mice.METHODSColistin sulphate 7.5 mg·kg－1was iv administered to Kunming female mice，twice a day.The mice were divided into colistin sulphate 1，3，7 d and 7 d post colistin sulphate groups according the adminstration for 1，3 and 7 d，respectively.The body mass and gait observations were obtained first，followed by determinations of foot splay and the threshold intensity(TI)，maximal intensity(MI)，compound action potential duration(CAPD)，latency of compound action potential(CAPL)，compound action potential amplitude(peak to peak)(CAPA)，and nerve conduction velocity(NCV)of sciatic-tibial nerve.Serum creatinine(Cre)and urea nitrogen(BUN)concentrations were determined before the first dose on 2nd day(d 2)，d 4，d 8 and d 15(the day of the first dose as the first day).RESULTSCompared with normal control group，after colistin sulphate was given for 1 d，Cre showed significant difference(P＜0.05);and for 3 d，BUN and body mass showed significant difference，respectively(P＜0.05);after colistin sulphate was given for 7 d，the gait and the foot splay showed significant difference(both P＜0.05).Compared with normal control group，after colistin sulphate was given for 1，3 and 7 d，TI increased by 60%，60%and 192%(P＜0.01)，respectively;MI increased by 4%，13%and 100%(P＜0.05)，respectively;CAPD increased by 15.1%，11.5%and 52.8%(P＜0.05)，respectively;CAPL prolonged by 9.0%，9.0%and 14.6%(P＜0.05)，respectively;CAPA decreased 0.92%，16.2%and 47.6%(P＜0.01)，respectively;and NCV decreased by 7.6%，7.5%and 12.7%(P＜0.05)，respectively.After 7 d of stopping administration，the gait and the foot splay had no significant differences，and all electrophysiology indexes showed a recovery tendency and only CAPA was significantly different(P＜0.05).CONCLUTIONNephrotoxicity is earlier than neurotoxicity on mice treated with colistin sulphate，at the same time，the progressive changes in CAP characteristics of the sciatic-tibial nerves are dependent with the time of colistin sulphate administration and abnormal CAPA has the longest duration time.

colistin sulphate;sciatic-tibial nerve;neurotoxicity

The project supported by National Natural Science Foundation of China(31272613);Scientific Research Foundation for the Returned Overseas Chinese Scholars by Heilongjiang Province(LC201018);Ministry of Education of China(41);Returned Overseas Project by Technological Innovation of Special Funds in Harbin City(2012RFLXN005);and Science and Technology Project of Heilongjiang Provincial Bureau of Education(12521043)

LI Ji-chang，E-mail:Lijichang828@sina.com，Tel:13613660929

R978.1

A

1000-3002(2012)06-0847-06

10.3867/j.issn.1000-3002.2012.06.012

国家自然科学基金(31272613);黑龙江省留学归国科学基金(LC201018);教育部留学回国人员科研启动基金(41);哈尔滨市科技创新人才研究专项资金留学回国人员项目(2012RFLXN005);黑龙江省教育厅科学技术项目(12521043)

代重山(1987－)，男，硕士研究生，主要从事药理与毒理学研究;李继昌(1967－)，女，教授，博士生导师，主要从事药理与毒理学研究。

李继昌，E-mail:Lijichang828@sina.com，Tel:13613660929

2011-12-20接受日期:2012-07-24)

(本文编辑:乔虹)