黄花菜多糖的超声提取工艺研究

白雪松，杜 鹃，杜泽辉 (吉林医药学院营养教研室，吉林吉林 132013)

黄花菜多糖的超声提取工艺研究

白雪松，杜 鹃，杜泽辉 (吉林医药学院营养教研室，吉林吉林 132013)

目的探索黄花菜中粗多糖的超声提取工艺。方法黄花菜干粉经脱脂，超声波提取，Sevag法除蛋白，醇沉，真空抽滤，得到黄花菜粗多糖。从超声频率、提取温度、提取时间、料液比4个方面对提取率进行了分析。在单因素试验的基础上通过正交试验筛选出最佳提取工艺条件。用苯酚-硫酸法测定多糖的含量。结果正交试验得出黄花菜多糖的最佳提取工艺为水料比1∶20，超声功率60 Hz，提取温度60℃，提取时间15 min，该条件下黄花菜中粗多糖含量为9.67%。结论采用超声方法提取多糖节省时间，提取多糖的含量高。

黄花菜;粗多糖;超声提取;正交试验

黄花菜(Hemerocallis fulva)又名金针菜、忘忧草、萱草，俗名金针花，为百合科多年生草本植物，《本草纲目》记载黄花菜有安神醒脑、增智宽胸、美容养血、解热消毒、除烦通乳之功效。黄花菜鲜甜味美，荤素兼优，在中国医学3000多年的食疗历史中，黄花菜被列为常用食疗食品之一［1］。黄花菜营养丰富，含有糖类、蛋白质、维生素、无机盐及多种人体必需的氨基酸。在现代生活中，黄花菜与香菇、木耳、冬笋一起被称为蔬菜类中的四大珍品［2］。植物多糖是一类由单糖组成的天然高分子化合物，广泛存在于多种植物中。大量药理及临床研究证实，多糖有调节免疫、抗癌、抗肥胖、控制血糖、降胆固醇、降血脂等生理功能，可广泛应用于医药、保健品及功能食品［3］，因此对植物多糖的研究已成为医药界的热门领域。本研究采用单因子试验和正交试验对超声波法提取黄花菜多糖的最佳条件进行研究，探寻黄花菜多糖制备工艺，为进一步开发黄花菜提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 药品与仪器

黄花菜购于吉林市;KQ-100DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);SHB-111A型循环水式多用真空泵(上海豫康科教仪器设备有限公司);RE-52AA旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂);UV-1800型紫外分光光度计(日本岛津);ZN-500A型高速中药粉碎机(长沙市岳麓区中南制药机械厂);HHS型电热恒温水浴锅(上海博讯实业有限公司医疗设备厂);202-1型电热恒温干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司);FA1104N型电子天平(上海精密科学仪器有限公司);所用试剂浓硫酸、葡萄糖、苯酚、正丁醇、丙酮、氢氧化钠、盐酸、三氯甲烷、乙醚、95%乙醇、无水乙醇均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。

1.2 样品处理

提取工艺:黄花菜→干燥→粉碎→脱脂→脱单糖、低聚糖→超声波萃取→过滤→滤液浓缩→醇沉→过滤→干燥→得黄花菜粗多糖。

将黄花菜放于烘箱在60℃烘烤12 h，烘干后，放于粉碎机中粉碎成粉末，过60目筛，得黄花菜粉末放于蒸发皿，置于干燥器中备用。使用电子天平称取干燥的黄花菜粉末2.000 0 g，用滤纸包成包，放到索氏提取器中，使用乙醚进行脱脂，回流时间4 h左右，至滤液呈无色透明，说明脱脂完全。用80%的乙醇在室温50 Hz超声提取30min脱去单糖，低聚糖及色素。取出后，放置室内通风处晾干24 h。

1.3 黄花菜粗多糖的提取

取5个锥形瓶，分别放入0.25 g脱脂脱糖后黄花菜粉，根据单因素和正交试验所设计的要求提取，之后使用四层纱布过滤，将滤液放入分液漏斗中，加入Sevag试剂(氯仿∶正丁醇 =4∶1)剧烈振荡15 min，静置25 min，弃去下面的有机层和蛋白层，得黄色溶液，反复多次，至无明显蛋白质出现为止，将得到液体置入150 mL锥形瓶。基于多糖是极性大分子化合物，可溶于水而不溶于醇的特点。待除蛋白后的液体冷却至室温后，边搅拌边向浓缩液中加入5倍体积的95%的乙醇进行醇沉，于冰箱中冷藏静置24 h。取出醇沉完全的粗多糖提取液，使用真空抽滤机，将溶液中的多糖析出到滤纸上，使用丙酮，无水乙醇洗涤，将析出的多糖放在室内晾干2 h，再放到烘干箱中于60℃烘干2 h至恒重，得黄花菜粗多糖。

1.4 黄花菜多糖含量的测定

称取50.50 mg的已经干燥好的黄花菜多糖的粗品，用蒸馏水溶解后定容至500 mL，吸取1 mL样液，分别放入5个具塞比色管中，再分别向其中加入1 mL 5%的苯酚，5 mL的浓硫酸，静置25 min，使用紫外分光光度计，测得各管吸光度值。样品中多糖含量的计算可以根据下列公式计算得到:

1.5 葡萄糖标准曲线的绘制

称取干燥至恒重的葡萄糖5.05 mg，加适量蒸馏水溶解，转移至50 mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀，配成浓度为101.0 μg/mL标准葡萄糖溶液备用。精密吸取浓度为101.0 μg/mL的葡萄糖对照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分别置于比色管中，依次加水使最终体积为1 mL，同时吸取1 mL蒸馏水于10 mL比色管中作空白对照，分别加入5%苯酚1 mL，摇匀，迅速加入浓硫酸5 mL，室温放置25 min。于490 nm波长处测定其吸光度，同时以蒸馏水作为空白。以吸光度(A)为纵坐标，葡萄糖浓度(C)为横坐标，绘制标准曲线，确定标准曲线的回归方程。

1.6 单因素实验

使用超声提取各单因素对多糖提取有影响，影响超声波提取的因素主要有超声波提取时间、提取温度、超声频率、水料比四个因素。确定四种因素对多糖含量提取的影响。

1.6.1 超声频率对黄花菜粗多糖含量提取的影响

取5个锥形瓶，分别取0.250 g脱脂脱糖后黄花菜粉，先确定提取温度50℃，提取时间10 min，水料比1∶20，分别在五个超声功率 40、50、60、70、80 Hz下提取，确定最佳提取频率。

1.6.2 提取时间对黄花菜粗多糖含量提取的影响

准确称取黄花菜干粉0.250 g，料液比为1∶20，温度50℃，超声频率50 Hz，选择不同的提取时间5、10、15、20、25 min进行超声波提取，确定最佳提取时间。

1.6.3 水料比对黄花菜粗多糖含量提取的影响

准确称取黄花菜干粉0.250 g，提取时间10 min，温度50℃，超声频率70 Hz，选择不同的水料比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 进行超声波提取，确定最佳水料比。

1.6.4 提取温度对黄花菜粗多糖含量提取的影响

准确称取黄花菜干粉0.250 g，水料比为1∶20，提取时间10 min，超声频率50 Hz，选择不同的提取温度 40、50、60、70、80 ℃进行超声波提取，确定最佳提取温度。

1.7 正交试验设计

根据以上单因素实验结果，采用L9(34)正交表以水料比(A)，提取温度(B)，提取时间(C)，超声频率(D)四个因素，选取各因素的较优区域3个水平做正交实验，每次做3个平行，取平均值。

表1 黄花菜中粗多糖超声提取正交试验

1.8 最优条件下提取黄花菜中粗多糖含量

准确称取黄花菜干粉2.000 0 g，水料比1∶20，超声频率60 Hz，提取温度60℃，提取时间15 min，进行超声波提取，得总粗多糖含量，本次试验做三个平行。

1.9 黄花菜多糖的回收率试验

向黄花菜中总粗多糖加入100.8 μg/mL的葡萄糖标准溶液1 mL，按实验方法测定，计算回收率。

2 结果

2.1 单因素实验

超声频率对黄花菜中粗多糖含量提取的影响:在40～60 Hz超声频率范围内，随着超声频率的增加，提取多糖的含量也明显增多，当频率超过60 Hz时，粗多糖含量提取明显下降，可能由于超声频率过快，导致多糖被破坏。

提取时间对黄花菜中粗多糖含量的影响:粗多糖含量随提取时间的增加而增大，提取初期粗多糖含量增长很快，10～15 min时多糖的提取率很高，但是超过15 min，多糖的提取率逐渐下降，可能是因为温度升高导致部分多糖降解。

水料比对黄花菜中粗多糖含量提取的影响:水料比在1∶10～1∶20时，黄花菜中粗多糖含量明显增加，当水料比在1∶20～1∶30时，提取的粗多糖含量明显下降，在水料比为1∶20时，提取率最高。随料液量的比例增加，多糖的提取率反而降低，可能是因为一些杂质的析出抑制了多糖的提取。

提取温度对黄花菜中粗多糖含量提取的影响:随着提取温度的增加，黄花菜中的粗多糖含量先增加后降低，提取温度在50℃时，粗多糖提取含量值最大，超过50℃后，随着温度的增高，多糖提取率逐渐下降，说明长时间受热会导致多糖的分解。

2.2 正交实验结果

由表2显示，从r值大小可以看出水料比对黄花菜中粗多糖提取效果的影响最大，超声频率次之，提取温度和提取时间的影响最小。最佳提取工艺组合即A3B2C2D3，即提取黄花菜中粗多糖的最佳提取工艺条件:水料比1∶20，超声频率60 Hz，提取温度60℃，提取时间15 min。

表2 黄花菜中粗多糖超声提取正交因素结果

2.3 最优条件下提取黄花菜中粗多糖含量

黄花菜在水料比1∶20、超声功率60 Hz、提取温度60℃、提取时间15 min条件下进行超声波提取，得粗多糖含量为9.67%。

2.4 黄花菜多糖的回收率试验结果与分析

由表3可见，黄花菜粗多糖的平均回收率为98.026%，RSD为6.98%。表明，用该方法测定黄花菜中总粗多糖含量的准确度较高。

表3 黄花菜中粗多糖的回收率

3 讨论

目前提取多糖的工艺有很多，具体有水煎煮法、酶法提取、超声提取方法等。研究表明，与传统的热水浸提法相比，超声法是利用超声波对细胞组织的破碎作用来提高多糖提取率，具有快速、安全、简便、成本低、多糖提取率高，成分又不被破坏等优点［4］。

本次实验超声提取黄花菜中粗多糖时，单因素水料比，超声频率，提取时间，提取温度对提取多糖影响很大。单因素水料比为1∶20时，提取率最高，继续增加黄花菜用量，多糖的提取率反而降低，可能是因为一些杂质的析出抑制了多糖的提取。当提取温度到达10～15 min时，多糖的提取率很高，但是提取时间大于15 min时，多糖提取率明显下降，说明长时间受热会导致多糖的分解。提取温度大于60℃后，多糖的提取率逐渐下降，可能是因为温度升高导致部分多糖降解［5］。超声频率为60 Hz时，多糖提取率最高，当超过60 Hz时，黄花菜多糖提取率逐渐下降，可能由于超声频率过快，导致多糖被破坏，所以黄花菜的粗多糖提取频率应该设置在60 Hz为宜。

综合考虑上述单因素对黄花菜粗多糖提取的影响，以黄花菜中粗多糖含量为指标，采用正交试验法，优选黄花菜中粗多糖的最佳提取工艺条件。结果表明，最佳超声提取条件为:水料比1∶20，超声功率60 Hz，提取温度60℃，提取时间15 min，在此工艺条件下多糖的提取率为9.67%。

［1］Uezu E.A philological and experimental investigation of the effects of Hemerocallis as food in man and ddY mice［J］.Bull Coll Educ Univ Ryukyus，1997，54:231-238.

［2］邓放明，尹 华，李精华，等.黄花菜应用研究现状与产业化开发对策［J］.湖南农业大学学报:自然科学版，2003，29(6):529-532.

［3］周启升，刘训理，段祖安.植物多糖的研究与开发应用进展［J］.蚕业科学，2010，36(3):465-469.

［4］朱晓霞，罗学刚.多糖提取与纯化技术应用进展［J］.食品研究与开发，2007，28(3):186-188.

［5］魏淑红.正交试验法优化半夏多糖的提取工艺［J］.生物技术，2010，20(2):42-44.

The extraction of polysaccharide of Hemerocallis fulva by the supersonic method

BAI Xue-song，DU Juan，DU Ze-hui (Department of Nutrition，Jilin Medical College，Jilin City，Jilin Province，132013，China)

ObjectiveTo study the extraction technology and contents of the polysaccharide from the hemerocallis fulva.MethodsThe polysaccharide of hemerocallis fulva were obtained by series steps of degreasing oligosaccharides，supersonic extraction，alcohol precipitation，trichloroacetic acid treatment and so on.According to the single factor experiment and orthogonal test，the optimum conditions for supersonic extraction of polysaccharide from the hemerocallis fulva were determined.The content of polysaccharides in hemerocallis fulva was determined by the method of phenol-sulfuric acid.ResultsThe orthogonal test showed that supersonic power was 60 Hz，extraction time was 10min，extraction temperature was 60 ℃ and the ratio of material to water was 1∶20.The extraction percent of polysaccharides from hemerocallis fulva was 9.67%.ConclusionCompared with traditional methods，supersonic extraction of polysaccharide can save time and increase the contents.

∶Hemerocallis fulva;polysaccharide;supersonic extraction;orthogonal test

TQ461

A

1673-2995(2012)05-0270-04

白雪松(1978－)，男(满族)，讲师，硕士.

2012-03-14)