鄂产竹节参的HPLC-DAD特征图谱研究

杨 桃，陈 新，李 龙，许 旭，胡 海，吴江磊，何 舟

(武汉工业学院生物与制药工程学院，湖北武汉430023)

竹节参 Panax japonicus C.A.Mey.为五加科人参属多年生草本植物的干燥根茎Rhizoma Panacis Japonici［1］，是我国名贵中药材中常用药材之一［2］，在心血管系统、神经系统、消化系统、免疫系统方面均具有药理活性［3］;竹节参中含有多种化学成分如糖类、皂苷类、黄酮类、挥发油类、含氮化合物、无机盐等，现代药理及多种文献报道表明其主要活性成分为皂苷类化合物，竹节参皂苷具有抑制肿瘤，镇痛抗炎，镇静，免疫调节等多种药理活性［4-7］，因此对竹节参进行系统的研究与开发具有一定的现实意义。

目前，HPLC指纹图谱在中药材制剂质量控制方面的运用逐渐受到多方重视，但指纹图谱的建立通常是以1种或几种指标成分作为对照为基础的，并没有对复杂多样的中药化学成分之间可能存在的协同作用进行考虑。因此，全息图谱逐渐被引入中药材的质量控制之中［8-9］。本文根据竹节参中总皂苷类化合物的化学性质，确定该类化合物的提取方法，并结合TLC、UV及HPLC全息图谱，对竹节参总皂苷定性分析，对该化合物进行指认，并为竹节参指纹图谱的建立提供一个很好的补充。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

竹节参(购于亳州药材市场)。

1.1.2 试剂试药

无水乙醇(分析纯)、超纯水、乙腈(色谱纯)、甲醇(色谱纯);竹节参皂苷Ⅳa、楤木皂苷A、竹节参皂苷Ⅰb、竹节参皂苷ⅴ(前期试验中制得，纯度＞98%，经核磁检测并鉴定其结构)

1.2 仪器与设备

Agilent 1260分析型单元液相色谱仪(美国安捷伦公司)，DAD检测器(G1315D 1260 DAD VL)，柱温箱(G1316A 1260 TCC);Molresearch1010A超纯水器-摩尔分析型超纯水器(重庆摩尔水处理有限公司);Ar2140型电子天平(沈阳龙腾电子有限公司;SB-5200双频超声清洗机(宁波新芝生物科技有限公司);BUCHI旋转蒸发仪(瑞士BUCHI公司)。

1.3 样品溶液的配制及色谱条件

1.3.1 竹节参皂苷提取物的制备

取干燥的竹节参粗粉1g，精密称定，置250 mL圆底烧瓶中，加入70%乙醇溶液100 mL，设定水浴温度80℃加热回流，回流提取3h，共提取三次，合并三次提取的滤液并浓缩，用70%乙醇定容于100 mL容量瓶中，得浓度为10mg原料/mL的供试品液，用0.45μm的微孔滤膜过滤，作为竹节参总皂苷提取物的供试品溶液，待测定。

1.3.2 液相色谱条件

色谱柱：Apollo C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm);检测波长：203 nm;柱温：30 ℃;流速：1 mL· min-1;进样量：20 μL;流动相：流动相A(0.05%磷酸水溶液)与流动相B(乙腈)进行梯度洗脱，洗脱比例如表1。

表1 梯度洗脱流动相

1.3.3 TLC展开条件

取少量浓缩后的提取物于EP管中，加适量甲醇稀释，点样于硅胶G板上，置于展开条件为氯仿∶甲醇∶甲酸(2∶1∶5‰)的展开缸中，展开后喷以10%硫酸乙醇溶液显色，观察硅胶板上的斑点情况。

2 结果与分析

2.1 竹节参皂苷提取物的TLC图谱

用硫酸试剂显色后的硅胶板如图1所示，板上呈现清晰的红色斑点，根据皂苷类物质的显色特征，可以初步判定为皂苷类化合物。

图1 竹节参总皂苷提取物TLC图

图1中原点为竹节参总皂苷提取液浓缩后样品，1—4分别为竹节参皂苷Ⅳa，楤木皂苷A，竹节参皂苷Ⅰb、竹节参皂苷ⅴ对照品，通过原液与对照品的Rf值大小的比对，及原液与对照品颜色的相似程度可以初步判断原液中含有该四种竹节参皂苷成分。该薄层色谱的展开条件是根据皂苷类化合物的性质通过多次实验摸索筛选优化而来。在展开剂中加入少量醋酸，是为了防止酸性皂苷产生拖尾现象。本文所用方法制备总皂苷提取物，简便易行。所用展开方式，快捷并且展开效果较好。

2.2 总皂苷提取物的HPLC—DAD图谱

根据《中国药典2010版一部》［10］，竹节参皂苷的HPLC检测波长为203 nm，在此波长条件下按照1.3.2色谱条件进样，样品的HPLC图谱见图2。

图2 竹节参皂苷提取物高效液相图谱

图3 竹节参皂苷全局三维图谱

分析图2可以看出，有部分物质由于浓度较小，在此图上呈现出小峰。根据文献报道［11］，四个峰面积最大的峰即1，2，3，4号峰为竹节参皂苷的主要成分。图3为竹节参皂苷的全局三维图谱，它采用光电二极管阵列作为检测元件，构成多通道并行工作，同时检测由光栅分光，再入射到阵列式接收器上的全部波长的光信号，然后对二极管阵列快速扫描采集数据，得到吸收值(A)是保留时间(tR)和波长(l)函数的三维色谱光谱图。由此可及时观察每一个竹节参皂苷组分的色谱图相应的光谱数据，从而迅速获得竹节参皂苷的紫外信息。

图2中标注的竹节参皂苷色谱峰对应的UV光谱图如图4所示。紫外分光光度法测定的是总皂苷，由于竹节参中皂苷大多为齐墩果烷型［12］，该类型的皂苷在波长为200 nm—400 nm处紫外吸收不明显，只有末端吸收，图4中1—4号峰的保留时间与该类型皂苷的紫外光谱一致，所以在利用UV测定时，在该波长范围内无明显紫外吸收的特征即可作为鉴定竹节参皂苷的依据。

图4 竹节参皂苷提取物的UV光图

3 结论

竹节参总皂苷具有抗炎镇痛及抗疲劳等活性，虽然竹节参皂苷种类繁多，除四种主要成分以外，其它皂苷的含量并不高。HPLC-DAD可对竹节参总皂苷成分进行有效地分离，同时可对皂苷主要成分色谱峰的紫外特征谱初步定性。目前，对皂苷类化合物的全息三维图谱分析还鲜有文献报道，本论文结合TLC、UV及三维图谱法同时对竹节参药材进行鉴定，方法简便、重现性好、专属性强，并且该法对竹节参总皂苷指纹图谱的建立是一个很好的补充。在中药化学成分的分析中，多波长指纹图谱适应复杂性的科学要求，实质是从多维信息角度揭示指纹图谱代表的整体化学指纹系统的全信息，它较单波长指纹图谱更能全面地反映中药的化学物质信息。

［1］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典2010年版(一部)［M］.北京：化学工业出版社，2010：129-129.

［2］ 中国药科大学，中国医药科技出版社.中药辞海(第1卷)［M］.北京：中国医药科技出版社，1993：2122.

［3］ 林先明，由金文，刘海华，等.竹节参开花结果习性观察［J］.湖北农业科学，2006，45(3)：347-348.

［4］ 吴锦忠，易骏，林小峰，等.人参属四种植物中氨基酸和无机元素的比较研究［J］.贵阳医学院学报，1992：17(3)：230.

［5］ 陈永波，饶斌，沈艳芬，等.竹节人参中氨基酸和皂甙特征组分的分析鉴别［J］.色谱，2003，21(3)：248.

［6］ 张玉涛，赵荣飞，刘和，等.黔产竹节参总黄酮苷的提取与测定方法研究［J］.安徽农业科学，2009，37(33)：16371-16372.

［7］ 陈永波，饶斌.竹节人参中氨基酸和皂苷特征组分的分析鉴别［J］.色谱，2003：248-250.

［8］ 孙国祥，吴波，毕开顺.平行五波长高效液相色谱指纹图谱全息整合法定量鉴定杞菊地黄丸的整体质量［J］.色谱，2010，28(9)：877-884.

［9］ 李萍，薛粲.试论中药材全息图谱质量评测人工智能系统构建［J］.世界科学技术—中药现代化，2001，3(4)

［10］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典2010年版(一部)［M］.北京：化学工业出版社，2010：7-7.

［11］ Rufeng Wang，Ping Chen，Fang Jia，et al.Optimization of polysaccharides from Panax japonicus C.A.Meyer by RSM and its antioxidant activity［J］.International Journal of Biological Macromolecules，2012，50，331-336.(SCI)

［12］ 陈永波，饶斌，沈艳芬，等.竹节人参中氨基酸和皂苷特征组分的分析鉴别［J］.色谱，2003(3).