心炎宁颗粒剂对病毒性心肌炎小鼠模型心肌细胞凋亡基因Bcl－2表达的影响

孟楠， 刘芳， 王雪峰， 张秋营， 周游， 南春红， 岳志军

心炎宁颗粒剂对病毒性心肌炎小鼠模型心肌细胞凋亡基因Bcl－2表达的影响

孟楠， 刘芳， 王雪峰， 张秋营， 周游， 南春红， 岳志军

目的 观察心炎宁颗粒剂对病毒性心肌炎小鼠心肌细胞保护作用及相关基因Bcl－2表达的影响。方法 采用腹腔注射柯萨奇B3病毒诱导BALB／c小鼠心肌炎模型，将心肌炎小鼠随机分为模型组、高剂量组、中剂量组、低剂量组各25只，另设正常组小鼠25只。在病毒感染后第3、5、7、14天动态观察不同剂量的心炎宁颗粒剂对心肌细胞保护作用和对相关调控基因Bcl－2表达的影响。结果 各剂量组较模型组心肌细胞病理损伤均减轻，其中高剂量组与模型组的病理积分差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组相比，高、中、低剂量组的Bcl－2表达均上调，其中高剂量组上调明显差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 心炎宁颗粒剂对感染柯萨奇病毒的小鼠心肌细胞有保护作用。

心肌炎； 心炎宁颗粒剂； 细胞凋亡； Bcl－2； RT－PCR； 动物，实验

细胞凋亡是个体发育过程中基因调控下的细胞自杀活动，是多细胞有机体为调控机体发育、维护内环境稳定，由基因调控的细胞主动死亡过程。目前普遍认为凋亡受基因的调控，其中Bcl－2家族中的Bcl－2原癌基因被认为可以阻止细胞凋亡的发生。病毒性心肌炎时心肌细胞既有坏死，亦可发生凋亡［1］。研究发现，细胞凋亡可能是导致病毒性心肌炎引起心肌损伤并演变为心肌病的原因之一［2］。心炎宁颗粒剂为本院治疗病毒性心肌炎的多年验方，其临床疗效显著。本实验旨在观察心炎宁颗粒剂对病毒性心肌炎小鼠心肌细胞的保护作用，以探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物与分组 雄性纯种BALB／c小鼠125只，4～5周龄，体质量15～20g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，中国医学科学院中国协和医科大学实验动物研究所，SPF级，证书号：SCXK京2009－0004。将125只BALB／c小鼠随机分为5组，即病毒性心肌炎模型组、正常组和高、中、低剂量组各25只。柯萨奇B3病毒（CVB3m）（Nancy株）由上海中山医院病毒性心脏病重点实验室杨英珍教授惠赠。在Hela细胞上连传3代，细胞病变至＋＋＋～＋＋＋＋（50%～100%细胞发生病变）后，反复冻融3次，3 000r／min离心30min，取上清液。在 HeLa细胞上滴定50%感染量（TCID50）为10－3.5，－80℃冰箱中保存留用。

1.2 仪器及试剂 一抗、二抗试剂盒、DAB显色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司），PBS缓冲液、蒸馏水、中性树胶、苏木素、枸橼酸缓冲液等。Trizol总RNA提取试剂（invitrogen公司），DNA－marker DL2000、RT－PCR 试剂盒（宝生物工程（大连）有限公司）。显微镜（OLYMPUS BX50），切片机（德国LEICA：RM2135），计算机图像分析仪（北京航空大学图像中心），微波炉（苏州三星电子有限公司，型号：7AMTA0188），电热恒温干燥箱（宁波机电工业研究设计院，型号：GZX－DH400－S），PCR仪（美国PE－9600），低温高速离心机（德国Biofuge 28RS），电泳仪，凝较分析系统（上海天能EPS－300）。

1.3 实验药物 心炎宁颗粒剂由柴胡、黄芩、红参、丹参等组成。由辽宁中医药大学附属医院制剂室制备（批号：辽药制字（2003）z0026）。各剂量组的药物浓度：高剂量组0.355g／mL，中剂量组0.177 5g／mL，低剂量组0.089g／mL。

1.4 实验方法

1.4.1 心肌炎模型的制备 模型组和各剂量组经腹腔内接种0.2mL TCID50CVB3m的MEM Eagle液，正常对照组同法接种0.2mL不含病毒的Vero细胞培养上清液。半小时之后，观察组按每次0.02mL／g灌胃给药，模型组和正常对照组分别给予等量的蒸馏水灌胃，每日2次，连续14d。造模第3、5、7、14天，各组随机取5只或剩余小鼠，麻醉处死并取其心脏。取心脏组织上1／3放入4%多聚甲醛固定液中固定，石蜡包埋，连续切片，备做病理组织学检测。取中1／3用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，连续切片，做免疫组化；取下1／3置于液氮－70℃中冻存备做RT－PCR。

1.4.2 病理组织学检查 常规HE染色，光镜下观察心肌病理变化，按照Rezkalla等［3］的方法计算心肌病理组织学积分。即每张切片取5个视野，计算每个视野中炎性细胞浸润及坏死区域面积与整个视野的面积之比。无病变计0分，＜25%计1分，25%～50%计2分，51%～75%计3分，＞75%计4分。

1.4.3 免疫组织化学法检测心脏组织的Bcl－2的蛋白表达 将石蜡切片脱蜡至水，用微波辐射对抗原进行修复或暴露，滴加正常山羊血清封闭液，室温放置20min。滴加用PBS 1∶100稀释的一抗，37℃，2h。滴加生物素化山羊抗小鼠IgG二抗，37℃，20min。滴加SABC，37℃，20min。DAB显色，苏木素复染，脱水、透明、封固、镜检。

采用计算机图像分析系统进行分析。阳性结果判断：以胞浆内出现棕黄色颗粒为阳性表达。阳性强度判断：每个切片随机取5个高倍镜视野，测定一定面积内阳性信号面积和阳性信号平均灰度值乘积，即免疫组织化学阳性信号指数＝阳性信号面积×阳性信号平均灰度／测定面积×100%。

1.4.4 RT－PCR方法检测心肌Bcl－2基因表达 采用Trizol试剂抽取心肌组织总RNA，将获得的总RNA按BcaBEST逆转录使用说明书进行合成cDNA。按RT－PCR试剂盒（宝生物工程有限公司）说明进行DNA扩增。Bcl－2和内参基因GAPHD引物由宝生物工程（大连）有限公司合成，序列如下：GAPHD1上游5＇GAC ATC AAG AAG GTG GTG AAG 3＇，下游5＇TGG AAA TTG TGA GGG AGA TGC 3＇计336bp；GAPHD2上游5＇ACC ACC ATG GAG AAG GCT GG 3＇，下游5＇CTC AGT GTA GCC CAG GAT GC 3＇计528bp；Bcl－2上游5＇TAG AGG AGG TGA CCA AGA TCG 3＇，下游5＇CAC AAT AAC ATG ACG GCA ACC 3＇计352bp。按下一条件进行扩增，94℃3min预变性，94℃30s、56℃30s、72℃1min，30个循环后72℃延伸5min。RT－PCR产物经2%琼脂糖电泳、电压条件为1～5V／cm，溴化乙锭染色后紫外灯下观察特异光带。

应用天能凝胶分析系统摄像、分析电泳结果，以内参照为标准进行半定量分析。计算公式：Bcl－2相对量＝Bcl－2产物电泳条带强度／内参电泳条带强度×100%。

1.5 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件分析，计量资料以±s表示，多组间比较用单因素方差分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠心肌组织病理改变 病毒感染后第3天，模型组与各剂量组心肌病理切片均出现数量不等的小炎症灶与点状坏死，各剂量组与模型组病理积分均有不同程度的升高，但差异无统计学意义（P＞0.05）。模型组于第5～14天有明显的心肌细胞变性和炎性细胞浸润，主要是淋巴细胞和单核细胞；于第7天病变达高峰，心肌有坏死，大量炎性细胞浸润。同阶段，3个剂量组病理改变仍以点状炎症及坏死灶为主，病变程度相对较轻，其中高剂量组与模型组的病理积分差异有统计学意义（P＜0.05）。正常组未见类似病理学改变。模型组与高、中、低剂量组小鼠感染后第3、5、7、14天心肌病变程 度比较见表1。

表1 心炎宁颗粒剂对各组不同时间病理积分的影响（±s，分）

表1 心炎宁颗粒剂对各组不同时间病理积分的影响（±s，分）

组别 n 第3天 n 第5天 n 第7天 n 第14天44高剂量组 5 1.41±0.37 5 1.30±0.24 5 1.27±0.41 8 1.22±0.59中剂量组 5 1.40±0.29 5 1.37±0.33 5 1.38±0.34 7 1.34±0.40低剂量组 5 1.59±0.22 5 1.53±0.28 5 1.51±0.25 5 1.46±0.33 F 23.291 23.566 17.591 11.791 P＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01模型组 5 1.40±0.32 5 1.75±0.39 5 1.87±0.47 10 1.84±0.

2.2 对心脏组织Bcl－2蛋白表达的影响 正常组小鼠心肌细胞有一定的Bcl－2表达。第3天，模型组、高、中、低剂量组的Bcl－2表达均明显下降，与正常组比较差异有统计学意义（P＜0.05），但4组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。第5～14天，模型组Bcl－2表达仍较正常组明显下降；3个剂量组Bcl－2表达开始增强，其中高剂量组与模型组差异有统计学意义（P＜0.05），而与正常组差异无统计学意义（P＞0.05）；中、低剂量组与其他组别相比差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表2 心炎宁颗粒剂对Bcl－2蛋白表达的影响

2.3 对心脏组织Bcl－2基因表达的影响 正常组可检测到Bcl－2的mRNA表达。第3天，模型组及各剂量组的Bcl－2表达均明显下调，且与正常组相比差异有统计学意义（P＜0.05），但4组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。第5～14天，模型组的Bcl－2表达仍较正常组明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；高剂量组Bcl－2表达增强，与模型组相比差异有统计学意义（P＜0.05），而与正常组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；中、低剂量组与其他组别相比差异无统计学意义（P＞0.05），见表3。

表3 心炎宁颗粒剂对Bcl－2基因的表达

3 讨论

病毒性心肌炎是指心肌细胞及其组织间隙受嗜心性病毒感染引起的局限性或弥漫性炎症，病理上常表现为心肌细胞变性、肿胀、溶解和坏死，以及细胞组织间隙中炎性细胞的浸润。其致病机制尚不明确，近年来认为心肌细胞的凋亡是导致病毒性心肌炎病情演变的原因之一［1］。当受病毒感染时，机体运用细胞凋亡的手段，通过牺牲个别细胞来清除外物，起到宿主的防御作用；另一方面，病毒可通过自身基因的表达，或激活宿主细胞凋亡相关基因，调控细胞凋亡，保证自身存活和繁殖，引起宿主病理改变。可见，细胞凋亡不仅是一种生理过程，也是一种病理损伤过程［4］。Bcl－2基因是一种对细胞凋亡具有明显抑制作用的新型癌基因，主要存在于线粒体外膜、核膜和内质网膜上。它对细胞死亡的干扰有选择性，但对细胞周期无明显影响，是阻止细胞死亡的最后途径。其能抑制由许多因子激发的细胞凋亡，如化疗药物、射线、某些病毒等。

本实验通过对不同时间的各组心肌细胞病理积分的测定，来评价心炎宁颗粒剂对心肌细胞的保护作用。第3天，各剂量组与模型组间无差异，可能是由于药物作用时间较短。第5、7、14天3个剂量组心肌组织受损程度均轻于模型组，从而推断心炎宁颗粒剂具有保护心肌细胞的作用。同时本实验运用免疫组织化学和RT－PCR两种方法测定Bcl－2在各组间的表达情况，发现与模型组相比，3个剂量组Bcl－2表达均有不同程度的上调，说明心炎宁颗粒剂有增强病毒性心肌炎心肌细胞Bcl－2表达的作用。

心炎宁颗粒剂为本院的院内制剂，由《伤寒论》中的经典方小柴胡汤加减而成，具有和解少阳、疏利三焦、活血化瘀的功效。其方主要由柴胡、黄芩、黄芪、丹参等组成。研究表明，柴胡提取物可以增强Bcl－2表达，减少心肌细胞凋亡，减少心肌损伤，预防心肌纤维及扩张性心肌病的发生［5］。黄芩可以通过调节研究对象组织细胞的Bax及Bcl－2的表达，抑制组织的进一步凋亡，从而起到保护组织损伤的作用［6，7］。黄芪有增强抑凋亡基因 Bcl－2的表达，减少组织凋亡数目的作用［8，9］。丹参能显著上调自发性高血压大鼠心肌细胞Bcl－2基因蛋白表达，抑制心肌细胞凋亡，从而预防高血压左室肥厚的形成［10］。本实验表明，心炎宁颗粒剂能够增强抑凋亡基因Bcl－2的表达，可能以此方式来降低心肌细胞凋亡的产生，减少心肌损伤，从而起到保护心肌的作用。

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Effects of Xinyanning granule on the expression of apoptosis gene Bcl－2 of cardiomyocyte in mice with viral myocarditis

MENG

Nan，LIUFang，WANGXue－feng，etal.LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicineGraduateSchool，Shenyang110032，China

Objective To investigate the protective effect of Xinyanning granule on myocardial cells and apoptotic regulator gene Bcl－2expression in mice with vital myocarditis.Methods The BALB／c mice inoculated with the cardiomyocytophilic strain Coxsackie virus B3m（CVB3m）by peritoneal injection were adopted as viral myocarditis model.The experimental mice were divided into the normal control group，the model group and three does groups.To observe the influence of myocardial cells and apoptotic regulator gene Bcl－2expression among at different doses groups，on the 3th，5th，7th，14th day after modeling.Results Pathology scores in three does groups were all significantly lower than that in model group，especially the high does group（P＜0.05）.The expression of Bcl－2in three does groups were all significantly higher than that in model group，especially the high does group（P＜0.05）.There is some correlation between pathology score and the expression of Bcl－2.Conclusion Xinyanning granule can protect the myocardial cells of mice with viral myocarditis.

Myocarditis； Xinyanning granule； Apoptosis； Bcl－2； RT－PCR； Experiment，animal

辽宁省重点实验室课题（2008S152）

110032沈阳，辽宁中医药大学研究生院（孟楠，张秋营，周游）；辽宁中医药大学附属医院儿科（刘芳，王雪峰，南春红，岳志军）

孟楠（1986－），女，辽宁中医药大学2010级硕士研究生在读。研究方向：小儿病毒性心肌炎的诊断与治疗。

刘芳，110032沈阳，辽宁中医药大学附属医院儿科。

10.3969／j.issn.1674－3865.2012.06.007

R－33

A

1674－3865（2012）06－0496－04

2012－09－10）

黄伟）

临床研究