涎腺非霍奇金淋巴瘤相关基因表达及意义

蔡杰，张品南，郭群

（1.温州医学院 仁济学院，浙江 温州 325035；2.温州市第三人民医院 病理科，浙江 温州325000）

涎腺非霍奇金淋巴瘤相关基因表达及意义

蔡杰1，张品南2，郭群2

（1.温州医学院 仁济学院，浙江 温州 325035；2.温州市第三人民医院 病理科，浙江 温州325000）

目的：分析涎腺非霍奇金淋巴瘤的临床病理特点，探讨其分子遗传学特征及意义。方法：依据2008年WHO肿瘤分类标准对标本重新诊断核实。采用IgH、MALT1、bcl-6、c-myc、bcl-2、CCND1、bcl-10、FOXP1双色分离重排探针、IgH/bcl-2双色融合易位探针和18号染色体着丝粒探针，利用间期萤光原位杂交（FISH）的方法检测32例涎腺非霍奇金淋巴瘤的分子遗传学特点。结果：32例淋巴瘤中黏膜相关淋巴组织结外边缘区B细胞淋巴瘤（MALT淋巴瘤）28例（占87.5%），滤泡性淋巴瘤2例，弥漫性大B细胞淋巴瘤2例。60.7%（17/28)的涎腺MALT淋巴瘤携带分子遗传学异常。其中IgH基因断裂1例，但未找到与其发生相互易位的伙伴基因；基因3拷贝者16例，其中MALT1基因、bcl-6基因和c-myc基因3拷贝的发生率分别为25%（7/28)、43%（12/28）和7%（2/28）。16例基因3拷贝病例中，两种基因3拷贝合并存在者5例，其中bcl-6基因合并MALT1基因3拷贝者4例，bcl-6基因合并c-myc基因3拷贝者1例。进一步研究显示，MALT1基因3拷贝者均存在18号染色体三体。2例滤泡性淋巴瘤都携带t（14；18）（q32；q21)/IgH-bcl-2。2例弥漫性大B细胞性淋巴瘤均存在遗传异常，1例表现为bcl-6基因3拷贝合并18号染色体三体，另1例表现为bcl-6基因3拷贝合并IgH和c-myc基因双断裂。结论：MALT淋巴瘤是涎腺常见的淋巴瘤类型；间期FISH有助于淋巴瘤的分类；MALT1基因3拷贝者由18号染色体三体所致；18号染色体三体和bcl-6基因3拷贝（可能为3号染色体三体所致）是涎腺MALT淋巴瘤常见的分子遗传学异常。

涎腺肿瘤；淋巴瘤；原位杂交；免疫组织化学

原发于涎腺区域的淋巴瘤少见[1]。这主要是因为正常涎腺组织中无淋巴细胞参与组成，只是在发生涎腺的自身免疫性疾病（如原发或继发Sjogren综合征有关的肌上皮性涎腺或淋巴上皮性涎腺炎）时，其涎腺导管周围出现淋巴组织的基础上淋巴细胞克隆性增生形成肿瘤。原发于涎腺的淋巴瘤通常有4个主要类型，即黏膜相关淋巴组织结外边缘区B细胞淋巴瘤（extranodal marginal zone B-cell lymphoma of mucosa massociated lymphoid tissue，MALT淋巴瘤）、淋巴浆细胞淋巴瘤（lymphoplasmacytic lymphoma，LPL）、弥漫性大B细胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)、滤泡性淋巴瘤（follicular lymphoma，FL），其中以MALT淋巴瘤最常见。淋巴瘤的确切诊断和准确分型对其治疗和预后的判断甚为关键。WHO肿瘤分类及诊断标准明确指出，淋巴瘤的诊断和分型需要结合临床特征、形态学改变、免疫表型及分子遗传学改变4个方面的资料进行综合判断。分子遗传学改变不仅有助于疾病的诊断和分型，其在指导治疗、预后评估和揭示发生机制等方面也具有重要意义。目前国内关于涎腺淋巴瘤的研究主要集中于临床病理学，而分子遗传学的研究报道较少[2-3]。我们收集32例涎腺淋巴瘤组织标本，分析其临床病理特征，并探讨其分子遗传学特点及其意义。

1 资料和方法

1.1 一般资料 收集温州医学院附属第一医院和温州市第三人民医院1990-2010年涎腺区域原发性涎腺淋巴瘤32例，其中发生于腮腺26例，颌下腺4例，舌下腺2例。男27例，女5例，平均年龄53.70岁。均以局部渐进性增大的无痛性肿块为首发症状而就诊，仅5例伴发热，3例伴全身（2处以上）其他部位浅表淋巴结肿大，多为双腮腺区、双颌下或单侧腮腺（颌下）及颈部淋巴结肿大。本组32例均行手术后加化疗。2例DLBCL患者因脑出血和继发感染分别于术后3个月和1.5年死亡。存活30例中，大于10年和5年分别为25例和5例，现仍续访。所有肿瘤标本均经4%甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋，HE染色，光镜观察，并经两位经验丰富的病理医师参照文献及WHO标准[4]进行诊断分类。

1.2 免疫组织化学染色 采用EnVision法，DAB显色，阳性信号为棕黄色颗粒。选用CD20、CD79a、CD3、CD45RO、AE1/AE3、CD5、CD23、CD10、cyclinD1抗体。二抗为鼠、兔通用试剂（均购自丹麦DaKo公司）。每组病例均设立阳性对照及阴性对照（为已知的相应标记物阴性或阳性的淋巴瘤组织），并以TBS代替一抗作空白对照。

1.3 间期荧光原位杂交（FISH） 所用探针为IgH、MALT1、c-myc、bcl-6、bcl-2、CCND1、bcl-10、FOXP1双色分离重排探针、IgH/bcl-2双色融合易位探针和橙色18号染色体着丝粒探针。所有探针均购自美国Vysis/Abbort公司。其操作以4～5 um厚的石蜡切片常规脱蜡，水化后按文献[5]步骤操作完成。结果判定：双色分离重排探针制剂均含有以绿色和橙色荧光素标记的两个探针，其分别与所检测靶基因的两端（telomeric和centromeric）杂交，在相应双色滤光片下观察，正常间期细胞核中存在橙色和绿色融合而成的两个黄色融合信号；当相应基因出现断裂时（如与另一染色体上的基因发生易位）间期细胞核中出现一个黄色的信号、一个单独的橙色和一个单独的绿色信号；当所检测靶基因出现拷贝数增多时，细胞核内出现多于2个的黄色融合信号。IgH/bcl-2双色融合重排探针以绿色标记整个IgH基因，以橙色标记整个bcl-2基因，正常情况下，细胞核中出现两个单独的橙色信号和两个单独的绿色信号；当存在t（14；18）（q32；q21）染色体易位时，细胞核中出现阳性信号，典型类型一个黄色的融合信号、一个单独的橙色和一个单独的绿色信号。18号染色体着丝粒探针以橙色标记整个着丝粒，正常情况下，在细胞核中显示两个橙色信号；当存在18号染色体数量异常时，细胞核中则显示相应数量的橙色信号。每例计数至少100个带有完整信号的间期细胞核。本组研究正常细胞出现假阳性信号的频率为：IgH（3.0±1.0）%、MALT1（1.0±0.3）%、bcl-6（1.0±0.6）%、c-myc（3.0±1.6）%、bcl-2（2.0±0.3）%、CCND1（1.0±0.3）%、IgH/bcl-2（1.0±0.5)%，及CEP18（1.0±0.2）%。

2 结果

2.1 分类 32例淋巴瘤均为B细胞非霍奇金淋巴瘤，其中MALT淋巴瘤28例（占87.5%），FL 2例，DLBCL 2例。

2.2 形态学、免疫组织化学表型 病变由单一、弥漫肿瘤细胞组成（见图1），瘤细胞均呈现CD20膜阳性（见图2）、CD79a胞质阳性，T细胞抗原CD3、CD45RO染色呈阴性。其中2例DLBCL镜下病变由弥漫增生的大细胞组成（见图3），细胞直径为小淋巴细胞的2倍或2倍以上，免疫表型为CD79a膜阳性（见图4）、CD10（-）、bcl-6（+）、Mum-1（-）、Ki-67为50%～60%。28例MALT淋巴瘤CD5、CD10、CD23、cyclinD1均阴性。2例FL CD5、CD23、cyclinD1阴性，CD10和bcl-2阳性。

图1 涎腺MALT淋巴瘤形态学改变，病变由单一、弥漫肿瘤细胞组成（HE，×100）

图2 涎腺MALT淋巴瘤病变CD20抗原表达呈CD20膜阳性（EnVision法，×200）

图3 涎腺DLBCL形态学改变，病变由单一、弥漫大B细胞组成（HE，×200）

图4 涎腺DLBCL病变CD79a抗原表达呈现膜阳性（EnVision法，×200）

2.3 分子遗传学改变 利用IgH、MALT1、bcl-6和c-myc双色分离重排探针所做间期FISH结果显示，28例MALT淋巴瘤中有1例IgH基因位点出现断裂（见图5），其余27例IgH、MALT1、bcl-6和c-myc基因位点均未见断裂（见图6）。对IgH基因断裂的标本，进一步利用bcl-10、FOXP1、bcl-2和CCND1双色分离重排探针寻找与IgH发生相互易位的伙伴基因，均未发现染色体在以上基因位点断裂。以上结果表明，28例MALT淋巴瘤中，1例肿瘤细胞存在涉及IgH基因位点的分子遗传学异常，但与其发生相互易位的伙伴基因不明；与MALT淋巴瘤相关的染色体易位 t（11；18）（q21；q21）、t（14；18）（q32；q21）/IgH-MALT1、t（1；14）（p22；q32）、t（3；14）（p14.1；q32）和涉及bcl-6基因的染色体易位发生率为0；其他淋巴瘤常见染色体易位t（14；18）（q32；q21）/IgH-bcl-2、t（11；14）（q13；q32）和t（8；14）（q24；q32）发生率也为0。28例MALT淋巴瘤中16例可见基因3拷贝（见图7）。其中MALT1基因、bcl-6基因和c-myc基因3拷贝的发生率分别为25%（7/28）、43%（12/28）和7%（2/28）。16例基因3拷贝病例中，两种基因3拷贝合并存在者5例，其中bcl-6基因合并MALT1基因3拷贝者4例，bcl-6基因合并c-myc基因3拷贝者1例。进一步采用18号染色体着丝粒探针检测结果显示，MALT1基因3拷贝者均存在18号染色体三体，且两者的荧光信号在数量分布上完全一致。对于FL利用IgH和bcl-2双色分离重排探针检测结果显示，染色体在IgH和bcl-2基因位点均发生了断裂，且分布一致。进一步使用IgH/bcl-2双色融合易位探针检测，可见IgH和bcl-2基因发生了融合，表明2例FL标本均携带t（14；18）（q32；q21）/IgH-bcl-2（见图 8）。对于DLBCL利用IgH、bcl-6、MALT1和c-myc双色分离重排探针和CEP18着丝粒探针所做间期FISH结果显示，2例DLBCL标本均bcl-6基因3拷贝，其中1例合并存在18号染色体三体，另1例还可见IgH和cmyc基因双断裂，即存在t（18；14）/c-myc-IgH。

图5 MALT1基因3拷贝；利用MALT1双色分离重排探针杂交后，肿瘤细胞间期核内由两个橙色和绿色融合而成的信号（FISH，×1 000）

图 6t（14；18）（q32；q21）/IgH-bcl-2；利用IgH/bcl-2双色融合易位探针杂交后，肿瘤细胞的间期核内出现2个橙色和绿色融合而成的信号，1个单独的绿色信号和一个单独的橙色信号（FISH，×1000）

图7 未发现遗传学改变的间期细胞核；利用bcl-6双色分离重排探针杂交后，肿瘤细胞间期细胞核内有两个橙色和绿色融合而成的信号（FISH，×1000）

图8 IgH基因断裂；利用IgH双色分离重排探针杂交后，携带IgH染色体易位的肿瘤细胞间期核内出现异常信号（1个橙色和绿色融合信号，1个橙色信号和1个绿色信号）（FISH，×1000）

3 讨论

涎腺恶性淋巴瘤少见，其发生与自身免疫和慢性感染密切相关，如舍格伦综合征和慢性自身免疫性甲状腺炎以及丙型肝炎病毒、EB病毒、人类嗜T淋巴细胞病毒及人类免疫缺陷病毒感染[6]。淋巴瘤的类型是淋巴瘤的重要预后因素之一。本组32例均为B细胞来源的非霍奇金淋巴瘤，其中MALT淋巴瘤28例，为最常见类型，此外还可见FL和DLBCL。

我们利用间期FISH方法对已确诊病例的遗传学特点进行了研究，结果显示，65.5%（21/32)的淋巴瘤标本携带遗传学异常，其中MALT淋巴瘤、FL和DLBCL分子遗传学异常的发生率分别为60.7%、100%和100%，表明利用间期FISH检测分子遗传学异常特点是淋巴瘤分类的有益补充。但需要说明的是，虽然在携带有分子遗传学异常的涎腺淋巴瘤中，间期FISH分析的意义是肯定的，但也有部分涎腺淋巴瘤并未检测到分子遗传学异常，因此，间期FISH阴性结果不能否定淋巴瘤的诊断。最后的病理诊断还需结合临床表现、形态学特点、免疫组织化学以及淋巴细胞克隆性分析等结果综合判断。

DLBCL的遗传学特点常常较为复杂，可涉及IgH、bcl-6、bcl-2以及c-myc等基因[7]。间期FISH结果显示，本组2例DLBCL的肿瘤细胞均携带遗传学异常，其中一例表现为bcl-6基因3拷贝合并18号染色体三体；另一例为bcl-6基因3拷贝合并t（8；14）/c-myc-IgH。c-myc基因是众所周知的癌基因，它的功能失调促使细胞进入细胞周期，在淋巴瘤特别是伯基特淋巴瘤（Burkitt lymphoma，BL）的发生中起着重要作用[8]。本组原发性涎腺淋巴瘤标本中，7%的MALT淋巴瘤出现c-myc基因3拷贝，其中1例DLBCL又存在t（8；14）/c-myc-IgH，提示cmyc基因可能参与了涎腺淋巴瘤的发生发展。t（8；14）（q24；q32）遗传学异常可见于80%～90%的BL和5%～15%的DLBCL病例中，但携带该染色体易位是否对DLBCL患者预后有影响尚有争议。常见的小细胞性B细胞淋巴瘤包括小淋巴细胞性淋巴瘤、FL、套细胞淋巴瘤和MALT淋巴瘤。各型小细胞性B细胞淋巴瘤间仅凭形态学特点常难以鉴别，免疫组织化学的发展大大促进了它们之间的鉴别诊断，但仍有一些病例难以确诊。研究表明，90%～95%的FL携带有遗传学异常t（14；18）（q32；q21）/IgH-bcl-2，几乎所有套细胞性淋巴瘤均存在t（11；14）（q13；q32）/IgH-CCND1，MALT淋巴瘤病例常存在涉及MALT1基因的遗传学异常，而不存在t（14；18）（q32；q21）/IgH-bcl-2和 t（11；14）[8-9]。本组 30例小细胞性B细胞淋巴瘤结合形态学和免疫标记，2例诊断为FL，其余28例均为MALT淋巴瘤。进一步选用IgH、MALT1、bcl-2双色分离重排探针和IgH/bcl-2双色融合易位探针，利用间期FISH方法检测其遗传学的特点，结果显示，2例FL肿瘤细胞均携带t（14；18）（q32；q21）/IgH-bcl-2而不存在t（11；14），28例MALT淋巴瘤均未见以上两种遗传学异常。表明间期FISH可应用于临床，作为各类型小细胞性B细胞淋巴瘤诊断和鉴别诊断的重要辅助手段，尤其在免疫组化不理想的情况下其作用更有意义。近年发现MALT淋巴瘤有四组显著不同的染色体易位类型：t（11；18）（q21；q21）/API2-MALT1、t（1；14）（P22；q32）/IgH-bcl-10、t（14；18）（q32；q21）/IgH-MALT1和t（3；14）（P14.1；q32）/IgHFOXP1，并涉及bcl-6基因的遗传学异常以及3、12和18号染色体数量的异常，与MALT淋巴瘤有关[9-11]。本组涎腺淋巴瘤中常见染色体易位的发生率为0，1例IgH基因断裂但未找到与其发生相互易位的伙伴基因，提示涎腺MALT淋巴瘤中可能存在尚未发现的涉及IgH基因的染色体易位。本组病例虽未见MALT1、bc1-6和C-Myc基因位点的断裂，但有57.1%（16/28）的病例出现基因3拷贝现象，bcl-6、MALT1和c-myc基因3拷贝的发生率分别为43%（12/28）、25%（7/28）和7%(2/28)。为了明确基因3拷贝现象与染色体数目的关系，我们进一步使用了18号染色体着丝粒探针对MALT1基因3拷贝全部病例进行检测。结果显示，MALT1基因3拷贝和18号染色体三体的细胞无论在数量还是分布上都完全一致，提示MALT1基因3拷贝是由18号染色体三体造成。我们虽未做3号和8号染色体数目的检测，但结合文献报道，推测bcl-6基因3拷贝和c-myc基因3拷贝可能也分别为3号染色体三体和8号染色体三体所致。目前，关于涎腺淋巴瘤的分子遗传学研究较少，染色体异常的发生率有关的文献鲜有报道。本组涎腺淋巴瘤中的MALT淋巴瘤病例其18号染色体三体和bcl-6基因3拷贝检出率高，常见MALT淋巴瘤的染色体易位检出率为0，这表明18号染色体三体和bcl-6基因3拷贝（可能为3号染色体三体所致）是本组MALT淋巴瘤最常见的遗传学异常。如上所述，利用间期FISH检测病变组织可作为淋巴瘤分类的重要辅助手段。MALT淋巴瘤是涎腺最常见的淋巴瘤类型，18号染色体三体及bcl-6基因3拷贝（可能为3号染色体三体所致）是其最常见的遗传学异常。MALT淋巴瘤对于手术或局部放射治疗敏感，预后较好[12]。但研究显示，发病于头颈部MALT结外边缘区的B细胞淋巴瘤存在高发病率和高复发率的特点[6]。但遗憾的是本组FL及DLBCL病例数少，有待积累更多样本进一步研究。MALT淋巴瘤有4组常见染色体易位类型，但本组未检测出该4组染色体易位类型，可能与病变部位或致病因素不同有关或有其他未知因素，尚待进一步研究。

[1] 石群立,张泰和,严小娟,等.涎腺粘膜相关淋巴瘤临床与病理研究[J].中华病理学杂志,1999,28(2):119-121.

[2] 赵洪波,李顺海,姚翠竹,等.涎腺淋巴瘤48例分析[J].山东医药,2000,40(14):96-98.

[3] Shi QL, Zhang TH, Xue QX, et al. Clinicopathologic study of mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma of the salivary gland[J]. Chin Med J,2001,114(1):44-47.

[4] 张品南,杨小敏,刘翠.新版WHO(2008)恶性淋巴瘤分类解读与应用[J].实用医学杂志,2011,27(5):338-340.

[5] 王桂秋,周英琼,宫丽平,等.用荧光原位杂交在石蜡切片上检测t(11;18)和涉及bcl-10基因的染色体易位的方法[J].中华病理学杂志,2007,36(7):494-495.

[6] 黄维维,平飞云.涎腺黏膜相关淋巴组织淋巴瘤的研究进展[J].国际口腔医学杂志,2009,36(5):577-579.

[7] Fu K,Iqba J,Chan WC. Recent advances in the molecular diagnosis of diffuse large B-cell lymphoma[J]. Expert Rev Mol Diagn,2005,5(3):397-408.

[8] Boxer LM,Dung CV.Translocations involving c-myc and c-myc function[J].Oncogene,2001,20(40):5595-5610.

[9] Jaffe ES,Harris NL,Stein H,et al.周小鸽,陈辉树,译.WHO肿瘤分类,造血与淋巴组织肿瘤病理学和遗传学[M].北京:人民卫生出版社,2006:171-175.

[10]Ye HT.Bcl-6 involved chromosomal translocation in MALT lymphoma of various sites[J].Mod Pathol,2005,18(suppl1):258A.

[11] 刘宏艳,吕宁.MALT淋巴瘤的分子遗传学进展及其在诊断中的价值[J].诊断病理学杂志,2011,18(5):380-382.

[12] 蒋龙翔,俞康,吴建波,等.抗CD20阳性淋巴瘤单抗真核表达载体的包装及增殖[J].温州医学院学报,2008,38(1):67-68.

Expression and clinic significance of gene-associated lymphoma of salivary glands

CAI Jie*，ZHANG Pinnan，GUO Qun.
*RenJi College，Wenzhou Medical College，Wenzhou，325035

Objective:To investigate clinicopathological and genetic characteristics of Lymphoma of salivary glands.Methods:Clinical，morphological and immunohistochemical feature of 32 cases of lymphoma in salivary glands were studied，including 5 cases of rective lymphoid hyperplasia and 32 lymphomas，retrospectivily. Classification of the lymphomas were made assording to the WHO classification of tumors of haemtopoietic and lymphoid tissues. All cases were studied with interphase fluorescence in situ hybridization(FISH)using dual color break apart probes of IgH，MALT1，bcl-6，c-myc，bcl-2，CCND1，bcl-10，and FOXP1 for detection of chromosomal aberrations，involving IgH，MALT1，bcl-6，c-myc，bcl-2，cyclinD1，bcl-10 and FOXP1 gene，repectively. FISH with IgH/bcl-2 dual fusion probe was used for detection of t(14；18)(q32；q21)/IgH-bcl-2. CEP18 sepctrum orange probe was used for detection of aneuploidy of the chromosome 18.Results:Among 32 cases of lymphoma，28 cases(87.5%)were extranodal marginal zone B-cell lymphoma of mucosa associated lymphoid tissue(MALT lymphoma)，2 cases were fol-licular lymphoma(FL)and 2 cases diffuse large B-cell lymphoma(DLBCL). Among the 28 cases of MALT lymphoma，chromosomal aberration were found in 60.7%(17/28)with interphase FISH analysis. One case showed positive IgH break-apart signal with unknown partner，16 cases showed three copies of different genes，of which，three copies of MALT1，bcl-6，and c-myc were identified in 7 cases(25%)，12 cases(43%)，and 2 cases(8%)of MALT lymphomas， respectively.In addition，5 cases showed two genes，including three copies of bcl-6 and MALT1 in 4 cases，and three copies of bcl-6 together with c-myc in one case. Furthermore，all cases with three copies of MALT1 had trisomy 18(14；18)(q32；q21)was detected in both follicular lymphomas.Of the 2 DLBCL cases，one showed three copies of bcl-6 together with trisomy18 and the other one showed three copies of bcl-6 together with IgH and c-myc rearrangements. Chromosomal aberration was not found in all 5 cases of reactive lymphoid hyperplasia.Conclusion:The most common entity of lymphoma of salivary gland is MALT lymphoma and FISH is helpful for their differential diagnosis and classification. Trisomy 18 and three copies of bcl-6 are common chromosomal aberrations in lymphoma of salivary glands.

salivary gland neoplasms；lymphoma；in situ hybridization；immunohistochemistry

R557.1

A

1000-2138（2012）06-0561-05

2012-02-24

蔡杰（1990-），男，浙江瑞安人，本科生。

张品南，主任医师，Email: zpn8271@126.com。

丁敏娇）

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