沙眼衣原体主要外膜蛋白多表位免疫血清中和活性分析

陈昊，巩文词，陈江，冯娟，吕艳，朱珊丽，陈向敏，薛向阳，张丽芳

（温州医学院 微生物学与免疫学教研室、分子病毒与免疫研究所，浙江 温州 325035）

沙眼衣原体主要外膜蛋白多表位免疫血清中和活性分析

陈昊，巩文词，陈江，冯娟，吕艳，朱珊丽，陈向敏，薛向阳，张丽芳

（温州医学院 微生物学与免疫学教研室、分子病毒与免疫研究所，浙江 温州 325035）

目的：制备高效价E型沙眼衣原体（Ct）主要外膜蛋白（MOMP）168多表位特异性免疫血清并研究其免疫学特性。方法：纯化的Trx-his/CtMOMP168融合蛋白经弗氏佐剂乳化后，小鼠背部皮下多点免疫注射，间隔2周后加强免疫，共3次，并分别于免疫前和每次免疫后2周取血，采用ELISA法检测血清融合蛋白和E型Ct全菌体特异性抗体水平及变化趋势，通过体外中和反应检测多表位特异性血清的免疫学特性。结果：小鼠用CtMOMP168多表位融合蛋白全程免疫后产生了抗融合蛋白和E型Ct全菌体特异性抗体，ELISA法检测最高滴度达1:500。ELISA和体外中和实验检测结果显示，该抗体能特异性识别MOMP多表位蛋白和E型Ct全菌体，并能有效抑制E型Ct感染Hela229细胞。结论：沙眼衣原体MOMP多表位融合蛋白免疫血清可特异性结合并中和E型Ct。

沙眼衣原体；主要外膜蛋白；表位；中和作用

沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis，Ct）是性传播疾病的主要病原体之一，感染普遍，且可增加HIV的感染概率，与宫颈癌的发生密切相关[1-3]，同时，Ct感染经抗生素治疗后易复发，给Ct的防治带来了困难，而疫苗研制是防治Ct感染的主要途径之一。Ct的主要外膜蛋白（major outer membrane protein，MOMP）占其总外膜蛋白量的60%，可诱导机体产生细胞免疫及包括中和抗体的体液免疫[4]，因而是研究Ct疫苗的主要靶抗原。以抗原表位为基础的疫苗，可同时携带多个目标抗原以及辅助性表位，通过B细胞表位诱导机体产生体液免疫反应，T细胞表位则诱导CTL效应，可达到同时诱导特异的体液免疫和细胞免疫，充分发挥预防控制作用的目的。本研究以前期原核表达的富含多个CTL、Th和B细胞表位的E血清型CtMOMP多表位融合蛋白为基础[4]，免疫小鼠，制备MOMP多表位融合蛋白免疫血清，并对其结合E型Ct全菌体的特异性及其中和活性进行了鉴定，为Ct感染的诊断和预防的进一步研究奠定了实验基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：健康BALB/c小鼠，雌性，5～7周龄，由温州医学院实验动物中心提供（浙动准字号：第22-08660）。

1.1.2 主要质粒和试剂：纯化的Trx-his/CtMOMP168融合蛋白由本实验室保存[4]。CtE型菌株购自ATCC，编号为：Trachoma serotype E VR-348B，-80 ℃保存；鼠抗His单克隆抗体购自美国ABR公司；HRP-羊抗鼠IgG（H+L）购自杭州联科生物公司；DAB购自索莱宝生物公司；蛋白Marker购自Ferments公司；Ni-NTA Agarose购自德国QIAGEN公司；弗氏佐剂购自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 Trx-his/CtMOMP168融合蛋白的表达及纯化参照文献[4]。

1.2.2 动物免疫：选择纯种健康BALB/c小鼠，共分3组，每组9只。实验前采集小鼠血清，作为阴性对照。然后分别用制备的Trx-his/CtMOMP多表位融合蛋白、Trx-his-tag蛋白和PBS进行免疫。按照0周、2周、4周、6周免疫程序进行免疫。首次免疫使用的佐剂为完全弗氏佐剂，第2、3次免疫采用不完全弗氏佐剂，分别与抗原等体积混匀并充分乳化后于小鼠背部皮下多点注射BALB/c小鼠，每只每次注射的Trx-his/CtMOMP多表位融合蛋白或Trxhis-tag蛋白量为50μg。于2周、4周、6周小鼠断尾取血，第3次免疫后2周摘眼球取血，分离血清，分装，置于-20 ℃下保存备用。

1.2.3 免疫鼠血清抗体效价测定：采用间接ELISA法。包被抗原为5μg/mL的多表位融合蛋白，加入不同时间段的血清，血清以1:1000倍稀释，HRP-羊抗鼠IgG（H+L）稀释度为1:5000。加入显色液显色后置Bio Elx 800酶标仪于490 nm处读取吸光度（A）值。所有血清标本均做3孔，取平均值。试验设标准阴性及空白对照。（待测标本A值－空白对照A值）/（阴性对照A值－空白对照A值）≥2.1为阳性。免疫血清与E型Ct全菌体的反应采用间接ELISA法：包被抗原为经适当稀释（105IFU/mL）的纯化Ct，血清进行倍比稀释度为1:100、1:500、1:2500、1:12500。余同上。（待测标本A值－空白对照A值）/（阴性对照A值－空白对照A值）≥2.1为阳性。阳性血清的最高稀释度即为该血清的抗体效价。

1.2.4 中和反应：体外中和实验步骤按文献[5-6]所述。将小鼠血清56 ℃灭活30 min，血清用含5%豚鼠血清（补体）的PBS按1:10、1:40、1:160倍稀释，104包涵体形成单位（inclusion forming units，IFU）的Ct加入到相应的血清稀释液和对照中，37 ℃ 孵育45 min，然后将混合物感染Hela229单层细胞，设置复孔，1000 r/min离心1 h，置37 ℃、5% CO2培养箱孵育2 h，加入1 mL含1.5 μg/mL的放线菌酮的DMEM。48 h后甲醇固定，碘液染色，400倍下随机计数15个视野，计数IFU。

1.3 统计学处理方法 采用SPSS 17.0 统计软件，用student’sttest 对数据进行统计学分析。本实验重复3次，实验数据以±s表示，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫鼠血清抗体水平ELISA法检测结果 小鼠经免疫，约2周后开始产生特异性血清抗体，抗体滴度随免疫次数的增加而升高，并于第6周达到A490最大值。CtMOMP168多表位免疫组在0周、2周、4周、6周时，其抗体ELISA读数分别是0.173±0.006、0.261±0.005、0.738±0.027、0.952±0.052，与Trx-his蛋白免疫组（0.163±0.015、0.2611±0.015、0.393±0.048、0.692±0.026）和PBS组（0.144±0.005、0.152±0.005、0.126±0.025、0.166±0.015）比较，在第4周和第6周差异有统计学意义（P＜0.05）（见图1）。

与其他两组比：*P＜0.05

2.2 免疫鼠血清对E型Ct全菌体特异性抗体滴度ELISA法检测结果 当稀释度分别为1:100、1:500、1:2 500、1:12 500时，CtMOMP168多表位组抗体水平分别是：1.100±0.045、0.351±0.014、0.180±0.002、0.155±0.003；Trx-his蛋白免疫组为0.219±0.010、0.191±0.013、0.141±0.002、0.129±0.006；PBS组为0.165±0.016、0.092±0.007、0.089±0.006、0.083±0.001。抗体效价为1:500和1:100时，与Trx-his蛋白免疫组和PBS组比较差异有统计学意义（P＜0.05）（见图2）。

图2 ELISA法检测免疫鼠血清抗E血清型Ct全菌体抗体的滴度

2.3 体外中和实验的检测结果 衣原体血清混合物通过感染Hela229单层细胞，同时设置104IFU衣原体与含5%豚鼠血清的PBS混合物为对照，48 h后，通过碘染计数IFU并计算各组抑制率。CtMOMP168融合蛋白免疫组在血清稀释10倍、40倍、160倍时，其抑制率分别是（0.599±0.068、0.514±0.058、0.325±0.099），与Trx-his蛋白免疫组（0.169±0.059、0.151±0.073、0.091±0.085）和PBS组（0.112±0.078、0.065±0.055、0.026±0.032）比较差异有统计学意义（P＜0.05）（见图3）。

图3 体外中和实验检测免疫鼠血清中和E血清型Ct的感染

3 讨论

目前，抗体的制备通常采用动物免疫、杂交瘤细胞技术等方法。利用杂交瘤技术制备的单克隆抗体具备纯度高、特异性强等优点，在临床诊断、治疗和实验研究中应用广泛。但是单克隆抗体仍然存在仅针对单个抗原表位的局限性，且制备技术要求严格，成本高。利用动物免疫制备的多克隆抗体在免疫学领域同样有着广泛的应用， 在临床应用中既能用于临床诊断又能用于疾病治疗[7]。与单克隆抗体制备技术相比，多克隆抗体虽然在特异性、稳定性方面不如单克隆抗体，但其制备周期短、工作流程简单、成本低、具有多个与抗原决定簇结合的位点等特点[8]，使其大量应用于免疫学研究。

Pal等[9]提取MoPn衣原体MOMP与不同的佐剂充分乳化后，肌肉免疫BALB/c和C3H/HeN小鼠，通过ELISA法检测抗体分型发现，其可以诱导产生较高水平的型特异性MOMP抗体，该抗体可识别MoPn的原体。Singh等[10]将霍乱毒素偶联MOMP后免疫BALB/c小鼠，通过ELISA法检测证明成功诱导出了MOMP特异性抗体。Sun等[11]用原核表达的重组MOMP蛋白免疫BALB/c小鼠，通过Western blot法检测发现，该蛋白免疫诱导产生的抗体可以识别MoPn原体。Su等[12]则将B细胞与Th联合组成多表位，与弗氏佐剂乳化通过鼻腔免疫小鼠，结果发现小鼠血清中IgG抗体与衣原体全菌体及其MOMP均可呈特异性反应。本研究以E血清型CtMOMP氨基酸序列为基础，利用计算机在线软件预测并筛选CtMOMP上的多个CTL表位，并结合文献报道的Th和B细胞表位，设计了富含CTL、Th和B细胞表位的多表位肽，经密码子优化，并通过原核表达系统制备了CtMOMP多表位蛋白[4]，通过皮下多点多次免疫BALB/c小鼠，可诱导产生高效价的E型Ct全菌体特异性抗体。

Ct主要通过黏膜途径感染机体，能有效诱导机体产生具有中和作用的抗体，对预防Ct病原感染至关重要[13]，因此中和抗原表位在Ct疫苗的研究方面具有重要意义。本研究通过小鼠免疫成功获得了E型CtMOMP多表位蛋白免疫鼠血清，并证明了该免疫血清能够特异识别E型Ct，并通过体外实验检测能有效地抑制Ct对Hela229单层细胞的感染，其抑制率随抗体效价的升高而升高，表明其能有效阻止Ct的感染，具有中和活性，为Ct诊断和预防的进一步研究奠定了实验基础。

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[13]Peterson EM, Zhong GM,Carlson E,et al. Protective role of magnesium in the neutralization by antibodies of Chlamydia trachomatis infectivity[J].Infect Immun,1988,56(4):885-891.

Neutralization activity ofChlamydia trachomatisMOMP multi-epitope protein immune serum

CHEN

Hao，GONG Wenci，CHEN Jiang，FENG Juan，LV Yan，ZHU Shanli，CHEN Xiangmin，XUE Xiangyang，ZHANG Lifang.
Department of Microbiology & Immunology，Institute of Molecular Virology and Immunology，Wenzhou Medical College，Wenzhou，325035

Objective:To prepare high-titer immune serum specifically against multiepitope fusion protein ofChlamydia trachomatis(Ct)major outer membrane protein(MOMP168)and analyze its immunological characteristics.Methods:BALB/c mice were subcutaneously immunized with the purified Trx-his/CtMOMP168 protein formulated with Freund adjuvant. Three vaccinations were given at 2-week intervals. Sera were taken prior to the first immunization and 2 weeks after each immunization. The specific antibodies to the fusion protein and the whole cell ofCtwere assayed with ELISA. The immunological feature of immunized sera was tested by in vitro neutralization assays.Results:All immunized mice produced high-titer specific antibody to the fusion protein and the whole cell ofCtserotype E after full immunizations. The highest antibody titer was arrived at 1:500. As measured with ELISA and in vitro neutral-ization assays，specific antibodies induced not only perfectly recognized the Trx-his/CtMOMP168 fusion protein and the whole cell ofCtserotype E， but also displayed a significant inhibitory effect on the invasion ofCtserotype E to Hela229 cell.Conclusion:The immune sera against theCtMOMP multi-epitope fusion protein can specifically bindCtof serovar E and show neutralization activity.

Chlamydia trachomatis；major outer membrane protein（MOMP）；epitope；neutralization

R3

A

1000-2138（2012）01-0006-04

2011-03-25

国家自然科学基金资助项目（30972669）。

陈昊（1985-），男，山东单县人，硕士生。

张丽芳，教授，博士生导师，Email：zhangli fang08@126.com。

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丁敏娇）

·论 著·