海洋有毒甲藻Coolia monotis的研究概况

梁计林, 龙丽娟

(1．中国科学院 南海海洋研究所 广东省海洋药物重点实验室, 广东 广州 510301; 2．海南省海洋监测预报中心, 海南 海口 570206)

海洋有毒甲藻Coolia monotis的研究概况

Review of marine toxic dinoflagellateCoolia monotis

梁计林1,2, 龙丽娟1

(1．中国科学院 南海海洋研究所 广东省海洋药物重点实验室, 广东 广州 510301; 2．海南省海洋监测预报中心, 海南 海口 570206)

甲藻(Pyrrophyta)又称双鞭毛藻(Dinoflagellates),是海洋浮游植物的重要种群之一, 其种类繁多, 全世界已记录的约有130个属, 1200个代表种。随着赤潮的频繁出现及赤潮毒素的强效活性的发现, 有毒甲藻的危害及医药作用日益引起人们的重视。赤潮毒素是海洋生物活性物质中研究、开发进展最为迅速的领域之一。本文以南中国海常见的一种海洋附生有毒甲藻Coolia monotis为论述对象, 从分类学、生理学和化合物研究3个层次对其进行综述。

1 分类学研究

Coolia是甲藻门的一个属, 1919年由Meunier确立, 中国内地未定其中文名, 中国台湾地区用库里亚藻称之。迄今共报道共有 3个种, 分别为Coolia monotisMeunier、Coolia tropicalisFaust以及 2000年由 Ten-Hage宣布发现的印度洋新种Coolia areolataTen-Hage。C.monotis是棕黄色近圆形单胞藻,具两条鞭毛, 为光合自养型, 叶绿体呈圆盘状, 个体直径大小25～50μm。

由于C.monotis在形态上与其他一些藻类很相似,其分类地位的确定曾出现过反复[1-2]。Ehrenberg和Schimdt分别在1837年和1901年用光学显微镜观察,把其归入Glenodinium属和Ostreopsis属。1919年,Meunier则根据甲片排列形式把其从Ostreopsis属中独立出来, 单独成立为Coolia属。1937年Schiller[3]发现C.monotis的上壳甲片结构与Ostreopsis属极相似, 将其又归Ostreopsis属中。一直到了20世纪80年代, Steinta提出以甲片排列形式作为多甲藻目分类的依据, 大家的意见才开始趋于一致。

扫描电镜(SEM)是现代显微观测的有效手段,它可以清楚地观察到C.monotis的壳板组成和壳上的小孔。借助SEM, 多位科学家[4-5]对C. monotis的分类地位进行了重新认定。1992, Faust[6]利用SEM对C. monotis的形态进行观察, 从甲片的排列形式上鉴定此种, 并详细描述了此种的形态结构, 将其划入Coolia属中。1997, Rhodes等[7]对于澳大利亚海域采集的Coolia进行 SEM观察。发现分离出的Coolia个体较 Faust描述的C. monotis要小些, 而与C.tropicalis相近, 但经过壳板尤其是上甲壳甲板的对比从而确定为C. monotis。

2 生理生态学研究

C.monotis是广温广盐种, 世界范围内的热带、亚热带海域多有分布, 生活在近岸浅海。有实验证明C.monotis能在盐度 15～60的环境中存活[8], 温度16～32℃间仍能生长[9]。C.monotis具有浮游、底栖、附生3种生活形态。C.monotis细胞底部的小孔能分泌黏液[6], 用以附着在大型藻体上, 群体在水体中分泌的这些黏液通常黏连成网状, 蔓布在海草间[10]。

Faust[6]用干涉对比的方法在光学显微镜下对实验室培养的C.monotis进行了生活状态的观察, 发现C.monotis存在无性生殖和有性生殖两种繁殖方式。据一些学者[11-12]的观点, 海藻在营养条件良好时主要以前者为主要繁殖方式, 当培养条件发生变化——通常是养分损耗的时候, 又尤其是氮含量降低的情况下会诱发有性生殖。C.monotis的有性生殖在其天然栖息地——红树林海域曾被观察到, 那里的沉积物中氮含量比较低, 约为5mg/g[13]。除营养盐浓度因素外, 其他因素也是发生有性生殖的诱发原因。在诱发有性生殖的实验中, Faust[6]采用了较野外水温 24～32.5℃低的 23℃; 光暗周期也由野外的13h:11h变为10h:14h; 盐度则由野外33～38固定为36; 光照强度则降低至1 900～5 700 lx, 低于野外的9 500～12 000 lx。C.monotis的无性生殖为等二分裂,有性生殖以同配生殖方式进行。

对于C.monotis的实验室培养, 各个实验室根据实验目的的不同选择了不同的培养条件,其中多数的培养目的是用于动物实验以测定其是否具有毒性,尚未有过全面综合的最适培养条件及最大培养密度测定。这些实验中采用的培养基有ES-1、GP以及f/2等[6,14]。温度、光照等其他条件根据各自实验情况的不同在C.monotis的存活范围内选择。从培养的结果比较来看, 刘宁宁等[9]进行的单因子生长条件实验在28℃、盐度34、光暗周期12h : 12h、光照强度约2 000 lx, 使用2倍改良K培养液的条件下, 获得了最大的细胞密度, 为6×104个/mL, 这是迄今为止有报道的最大培养密度。

3 化合物研究

海洋甲藻通常具毒性, 被认为是造成有害赤潮的元凶, 但随着赤潮毒素的强效活性的发现, 有毒甲藻的医药作用日益引起人们的重视。因此从甲藻中分离出毒素, 测定其分子结构并进行药理、药化研究以阐明其致毒机理, 在充分了解其构效关系的基础上将其作为模型化合物进行辅助基团改造等化学修饰, 以期在确保疗效的基础上降低毒性, 已成为研究毒素类海洋治疗药物的常规途径。近十多年来,各国学者对各种毒素的来源、类型、化学结构以及作用机制作了大量研究, 取得了可喜的进展。从目前的研究进展来看, 甲藻毒素在研究癌症机理和开发抗癌、镇痛、麻醉、抗病毒、抗菌等各种治疗药方面有着非常广阔的应用前景。此外, 甲藻毒素作为药理研究工具药的应用前景也非常广阔。

20世纪90年代之前C.monotis都被认为是不产生毒素的, 然而 1995年澳大利亚科学家 Holmes等[15,16]发表的论文指出, 他们从澳大利亚海域分离出的C.monotis中发现一分子量为1062的钠盐具有毒性, 命名为Cooliatoxin。对小鼠进行腹腔注射,LD50为 1mg/kg, 中毒症状为先经过一个未见中毒症状的延迟期, 然后出现体温下降并且呼吸衰竭。然而这种中毒现象并未在当时已证实的鱼类毒素中发现,可以认为Cooliatoxin不会通过在鱼体内的积累而致人中毒。

Rhodes等[14,17-18]对C.monotis进行了一系列形态、毒性方面的研究。通过 FITC标记血凝素检验(FITC-conjugated lectins)发现C.monotis能与Canavalia ensiformis和Helix pomatia结合, 但不能与Erythrina cristagalli结合, 推断出C.monotis能产生 N-乙酰基-D-半乳糖氨, 而不含α-乳糖。而与C.ensiformis的结合则可以证明其中含有甘露糖、葡萄糖、吡喃甘露糖中的一种或几种。在卤虫(Artemia salina)的培养中加入C.monotis, 结果表明C.monotis能引起A.salina形态变异而非致死。他们进行的毒性实验证实不同品系的C.monotis其提取物对小鼠的致死效力不同, 4个实验品系中有一个在220 s使小鼠致死, 死亡征兆与一种叫做Rangaunu Harbour Toxin(RHT)的毒素致死征兆相似(此毒素在利玛原甲藻Prorocentrum.lima中存在), 而其他 3个品系却对小鼠无致死效力。另外, 实验中C.monotis的提取物在成神经细胞瘤(neuroblastoma)测定中能激活钠离子通道。实验所用的4个C. monotis品系中, 均未发现Holmes[16]报道的毒素Cooliatoxin。但Rhodes在实验的 4个品系中的一个品系中发现有未知的聚醚类类似物, 另有一个品系的提取物具细胞毒性。他们的实验还检测出提取物有低水平的溶血活性, 但量太少还不足以确定是否是具溶血活性的沙海葵毒素(palytoxin, PTX)。

微藻常暴露在日照下受氧气包围, 但却含有丰富的不饱和脂肪酸而不被氧化, 这个特性也引起了科学家们的兴趣。20世纪90年代中期, 日本科学家Nakagawa, Murata等[19]试图从C.monotis中寻找到能清除自由基的活性物质。他们把C.monotis的提取物加入被氧化了的大鼠肺部微体脂肪, 以评估C.monotis所含化合物的抗氧化能力, 但实验结果表明其提取物并未表现出很强的抗氧化能力。同时他们还用 P388小鼠白血病细胞进行筛选实验, 加入Coolia monotis提取物以观察存活率。在选用的4个C.monotis品系中, 两个表现出了很强的毒性而另两个的毒性则不很明显。

对于C.monotis合成的化合物, Tanaka, Matsuoka等[20]用2D核磁、手性HPLC及CD的方法进行分析。在提取物中发现两种化合物: 一种是新发现的化合物, 一种未知的神经酰胺(图1), 此神经酰胺在当时已发现的天然产物中是首次发现 18碳脂肪酸在 C15位上有甲基取代。另一个是海藻中常见的二酰基半乳糖甘油脂(diacylgalactosyl-glycerolipid, 图2)。

2000年, Akasaka等[21]对上述的神经酰胺进行了进一步的研究, 利用反向 HPLC等方法确定了此化合物手性中心的绝对构像为R。

图1 带新颖支链的脂肪酸

图2 二酰基半乳糖甘油酯

2000年, 德国科学家Perovic等[22]在嗜铬细胞瘤细胞(PC12)和初级神经元(Primary neuron)的培养中加入C.monotis离心后的上清液。结果未发现这两种细胞有明显死亡现象, 证明C.monotis对其不具有毒害作用, 不影响神经细胞和突触的自由钙离子水平,对两种细胞的生长发育也无明显影响。

4 结语

C.monotis是分布范围较广的甲藻, 各国科学家对其进行了不同层次上的研究, 但由于在自然条件下,C.monotis数量通常较少, 在适宜生长季节一般也只占采样所得甲藻数量的5%以下, 而且在甲藻中属于较难培养种, 因而远远不能满足科学研究和实际利用的需要。据1995年的统计, 世界范围内仅有包括澳大利亚、新西兰等4个国家的5个实验室分别存有C.monotis的9个培养株[23]。由于原材料较难获得的制约, 目前国内外对于C.monotis的研究相对较少, 国外仅有数量有限的几篇报道, 对其次生代谢产物的结构、生物活性等方面的了解却还尚未深入、知之甚少。国内仅有对其形态及培养条件方面的研究, 尚未开展对其化合物方面进行探讨的工作。

C.monotis在我国广东、海南沿海均有分布, 中国科学院南海海洋研究所于1999年首次正式报道在南中国海发现C.monotis, 并且分离纯化获得藻株,并攻克了该种难保种难培养的瓶颈问题, 成为目前国内唯一一家存有该藻种的单位。目前仅对其形态及培养条件进行了初步的研究, 尚未开展对其化合物成分及毒素成分进行探讨的工作, 至于该南中国海地理品系是否为有毒种, 则需要通过一系列的试验才能证实。因此, 深入研究C.monotis的生长特性、次生代谢产物结构、生物活性等, 对进一步开发利用海洋资源, 造福人类有着非常重要的科学意义和现实意义。

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Q178.53 文献标识码: A 文章编号: 1000-3096(2012)01-0139-04

2010-09-12;

2010-12-10

中国科学院知识创新工程项目(KSCX2-YW-R-093); 广东省科技攻关项目(2002A3050502)(2005B60301032)

梁计林(1981-), 男(壮族), 广西柳州人, 博士, 工程师,专业为海洋调查与监测, 电话: 0898-68966795, E-mail: jinn77@163.com; 龙丽娟, 通信作者, E-mail: longlj@scsio.ac.cn

张培新)