毛细管气相色谱法测定甘氨双唑钠中有机溶剂残留量

罗淑青， 卓开华， 周 征， 曹 琳

(宁波市食品药品检验所，浙江宁波315048)

甘氨双唑钠为一种放射增敏药，体内外研究表明:其对S180肿瘤、食道癌、鼻咽癌、B16黑色素瘤和EMT6乳腺癌等均有较好的放射增敏效果［1-3］。该药于1983年由第二军医大学放射医学研究所立项研究，1993年9月由国家专利局授予发明专利权，并于2002年获得原SDA颁发的一类新药证书和生产批文，由广州莱泰制药有限公司独家生产上市，商品名为希美纳，后于2007年转让给山东绿叶制药有限公司。该药生产过程(包括合成、结晶)中需使用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、乙醇等有机溶剂，而根据国家食品药品监督管理局(SFDA)颁布的《化学药物研究技术指导原则》中的要求，合成工艺中用到的二类溶剂需进行残留溶剂检测。国家现行标准［WS1-(X-020)-2007Z］规定采用直接进样法检测其乙醇残留量，尚未规定对DMF进行检测，考虑到后者对人体的危害［4］，本文建立了气相色谱法以检查残留溶剂DMF和乙醇含量，并进行了方法学验证。

1 仪器与试剂

Agilent 7890N型气相色谱仪(美国Agilent公司)，配Agilent7683型自动进样器和Chemstation工作站。

甘氨双唑钠(山东绿叶制药有限公司提供，批号:091212;091216;100307);二甲基亚砜(DMSO，色谱纯，美国天地试剂公司，批号:905033);DMF (色谱纯，美国天地试剂公司，批号:912321);乙酸乙酯(色谱纯，国药集团化学试剂有限公司，批号: 10010320);无水乙醇(分析纯，国药集团化学试剂有限公司，批号:20110221)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:HP-FFAP毛细管柱(30 m×0.32 mm×0.25μm);柱温:程序升温，初始温度40℃保持5 min，以每分钟8℃的升温速率升至110℃，保持2 min，然后以每分钟30℃的升温速率升至230℃，保持2 min。载气:高纯N2，流速:3.0 mL·min－1，分流比:10∶1，进样口温度:230℃;检测器温度: 250℃;进样量:1μL。

2.2 溶液的制备

内标贮备液的制备:取乙酸乙酯约1.0 g，精密称定，置事先加入适量DMSO的200 mL量瓶中，加DMSO溶解并稀释至刻度，摇匀，得每1 mL含乙酸乙酯5 mg的内标贮备液。

乙醇贮备液的制备:取乙醇约250.0 mg，精密称定，置事先加入适量DMSO的50 mL量瓶中，加DMSO溶解并稀释至刻度，摇匀，得每1 mL含乙醇5 mg的对照品贮备液。

DMF贮备液的制备:取DMF约44.0 mg，精密称定，置事先加入适量DMSO的50 mL量瓶中，加DMSO溶解并稀释至刻度，摇匀，得每1 mL含DMF 880μg的对照品贮备液。

2.3 专属性试验

取DMSO 1μL进样，结果表明空白对测定无干扰［见图1(A)］。

2.4 系统适用性试验

精密量取乙醇贮备液和DMF贮备液各5.0 mL，置事先加入适量DMSO的50 mL量瓶中，加内标贮备液5.0 mL，再加DMSO稀释至刻度，摇匀，进样测定，记录色谱图。结果，各组分的分离度均大于1.5，理论塔板数均大于5 000［见图1(B)］。

2.5 线性关系考察

精密量取乙醇贮备液0.05、0.1、0.5、1.0、5.0和10.0 mL，DMF贮备液0.5、1.0、2.0、3.0、5.0和10.0mL，分别置事先加入适量DMSO的50 mL量瓶中，并分别加内标贮备液5.0 mL，再加DMSO稀释至刻度，摇匀，分别得每1 mL含乙醇 5.0、10.0、50.0、100.0、500.0、1 000.0μg和每1 mL含DMF 8.8、17.6、35.2、52.8、88.0、176.0μg的对照品溶液。分别进样，记录色谱图，分别以对照液峰面积与内标液峰面积比值(Y)为纵坐标，以质量浓度(X)为横坐标，绘制标准曲线，得乙醇回归方程为: Y=0.002 2 X－0.008 1(r=0.999 8);DMF回归方程为:Y=0.001 5 X－0.001(r=1.000 0)。结果表明:乙醇和DMF在上述质量浓度范围内，峰面积之比与质量浓度呈良好的线性关系。

2.6 精密度与稳定性试验

分别取对照品溶液乙醇(500 mg·L－1)和DMF (88.00 mg·L－1)，连续进样5次。结果，其峰面积RSD分别为0.15%和0.73%(n=5)，表明精密度符合药典要求;同时，在2、8、14、20、26 h进样，记录色谱图，得乙醇和DMF峰面积RSD分别为1.55%和1.15%，表明溶液在24 h内稳定。

2.7 加样回收率试验

取甘氨双唑钠9份，每份1.0 g，精密称定，置10 mL量瓶中，加适量DMSO使溶解，分别精密加入乙醇和DMF贮备液各0.8、1.0和1.2 mL，加入内标贮备液1.0 mL，并稀释至刻度，进样，根据峰面积比计算回收率。乙醇及DMF平均回收率分别为98.00%和97.32%(n=9);RSD分别为0.64%和0.12%(n=9)。

2.8 最低检出浓度

由混合对照品溶液逐级稀释，直到峰高的信噪比(S/N)为3，得乙醇和DMF最低检出质量浓度分别为2.5和4.4 mg·L－1。

2.9 样品测定

取3个批号(批号:091212;091216;100307)的甘氨双唑钠样品各约1.0 g，精密称定，置10 mL量瓶中，加适量DMSO使溶解，加内标贮备液1.0 mL，并稀释至刻度，摇匀，按“2.1”项下色谱条件进样分析，结果DMF未检出，乙醇有残留［见图1(C)］。按内标法以峰面积比计算得3批样品中乙醇残留量分别为0.44%、0.46%和0.46%。

图1 空白溶液(A)、混合对照品溶液(B)和供试品溶液(C)的色谱图Figure 1 Chromatograms of blank solution(A)，mixed standard solution(B)and sample solution(C)of glycididazole sodium

3 讨论

DMF的沸点高，不宜采用顶空进样法测定，根据中国药典中关于残留溶剂测定的指导建议，本实验采用直接进样法测定此类沸点较高的溶剂。甘氨双唑钠在水中易溶，但为保护色谱柱应尽量避免以水为溶剂，通过实验，发现以DMSO作为溶剂，也可将甘氨双唑钠完全溶解，且无基质效应，回收率好，故选择DMSO作为溶剂。

待测的有机残留溶剂为样品中微量的挥发性物质，且乙醇残留量将在甘氨双唑钠含量计算时予以扣除，采用内标法定量可减少由仪器系统或操作过程带来的误差。

在摸索色谱条件时，分别试用了HP-1、DB-624、HP-FFAP这3种型号的毛细管柱，结果发现在HP-1型毛细管柱上，2种溶剂和内标物乙酸乙酯均能较好分离，但柱效均不高;在DB-624型毛细管柱上，程序升温造成基线抬高，从而导致分离效果欠佳。在HP-FFAP型毛细管柱上，本实验曾试图通过增加程序升温速率来缩短DMF的保留时间，结果其在抬高的基线上出峰，致柱效下降，且对样品测定造成影响，无法判断有无溶剂残留以及空白溶剂是否有干扰;提高初始温度则导致乙醇与乙酸乙酯的分离度降低，不符合检测要求，最终通过改变程序升温的条件延长了 DMF的出峰时间，很好地解决了上述问题。

该法适用于甘氨双唑钠原料药中乙醇和DMF残留量的内标法测定。

［1］ 刘昌孝，魏广力，肖淑华.甘氨双唑钠在大鼠和小鼠体内药代动力学［J］.药学学报，2000，35(10):770-773.

［2］ 刘孟忠，卢泰祥，胡永红.甘氨双唑钠对鼻咽癌放疗增敏作用的临床研究［J］.中国肿瘤临床与康复，2003，10(3):199-202.

［3］ 王凤英，孙菁，鲍云华，等.甘氨双唑钠对食道癌放射治疗增敏作用的研究［J］.中国临床医学，2001，8(4): 369-370，372.

［4］ 夏元洵.化学物质毒性全书［M］.上海:上海科技出版社，1991:456.