松养心胶囊对兔心肌梗死后酪氨酸羟化酶mRNA表达及室性心律失常的影响

徐 红

(泰山医学院附属泰山医院心内科，山东 泰安 271000)

目前大量研究发现，心肌梗死后存在心脏交感神经再生、增生和不均一支配，交感神经重构与心肌组织重构、心肌电重构，共同成为心律失常和猝死的发生基质[1-5]。心肌梗死后再生神经以交感神经为主，酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase，TH)在分子生物学实验研究中，常被作为交感神经的标记物[6]，以探讨心律失常的神经机制。

现代医学认为心肌的氧化应激、炎性反应，细胞外基质的重塑和纤维化等共同参加了心律失常的发生过程，并成为抗心律失常药物作用的新靶点。参松养心胶囊(SSYX)是一种复方制剂，具有多离子通道和非离子通道的抗心律失常作用[7,8]。随机临床验显示，SSYX对治疗冠心病心律失常有明显疗效。但关于SSYX对MI后抗心律失常的机制和对心肌TH mRNA表达影响的相关研究鲜有报道。对此，我们进行了初步的探讨。

1 材料与方法

1.1 动物模型的建立和分组

45只新西兰兔[普通级，编号SCXK(鲁)20050015，2.5～3 kg]。购自山东中医药大学实验动物中心。

MI模型制备：3%戊巴比妥钠按40 mg/kg剂量行腹腔内注射麻醉、备皮。消毒后沿胸骨中线切开皮肤，暴露胸骨及肋软骨。贴紧胸骨左缘剪断第4～5肋骨，暴露纵隔及心脏，保持两侧胸膜完整，眼科镊夹起心包膜，剪开心包，暴露出冠状动脉。左心耳下缘至心尖部的中下1/3处用6/0线穿过心肌浅层缝扎前降支，进针深度约2.0 mm，记录心电图。心电图示ST段抬高，且结扎水平以下心肌局部颜色变暗，搏动减弱，观察20分钟后逐层关闭胸腔。术后均给予青霉素肌肉注射3天，预防感染，单笼喂养，予以自主饮食(水)。

MI模型制备后，30只兔随机分为心肌梗死组(MI组，n=15)和心肌梗死+参松养心胶囊组(SSYX组，n=15)。SSYX组自术后第1天给予参松养心胶囊药粉 0.8 g/kg·d灌胃；MI组给予0.9%氯化钠5 ml/kg·d灌胃；另取15只兔作为假手术组(Sham组)，冠状动脉穿线但不结扎，同期普通饲料喂养8周。

1.2 电生理试验

术后8周所有成模兔再次以3%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔内注射麻醉，心电监护，开胸，充分暴露心脏左室游离壁，缝制心包吊床。起搏电极由2支针形电极组成，电极直径 0.3 mm，两电极相距约3.0 mm，在梗死灶(梗死区苍白边缘2.0～3.0 mm)刺入2.0 mm。Sham组起搏电极放置在心脏的相应部位。

1.2.1梗死灶周(ERP)的测定

应用心脏电生理刺激仪(DF-5A型，苏州市东方电子仪器厂)以S1S2 160 ms逆扫，每次递减5 ms，测定梗死灶周心肌有效不应期(ERP)。

1.2.2程序电刺激诱发室性心律失常

在梗死灶周S1S2S3刺激和S1S1刺激8 min；未达刺激终点停止5分钟后再重复一次上述电刺激直至诱发出室性心动过速(VT)、室颤(Vf)，如未诱发出VT/Vf，则在ERP基础上增加 30 ms，加发S3刺激，直至诱发出VT/Vf。

1.3 总RNA的提取

应用Trizol(Invitrogen，美国)分别提取梗死灶周和非梗死左室游离壁心肌总RNA。100 mg组织块加入1 ml Trizol 匀浆，冰上孵育后加入0.2 ml氯仿，震荡，4 ℃离心(12,000转/分)10 min，取上清液移入新管；加入0.5 ml异丙醇，4 ℃离心(12,000转/分)5 min，弃去上清液；加入1 ml 75%乙醇洗涤，4 ℃离心(12,000转/分)5分钟，弃去上清液；DEPC处理水溶解RNA。紫光分光计测定260 nm、280 nm吸光度值(OD)，计算RNA总量。

1.4 逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)

应用RT-PCR试剂盒(大连宝生物工程有限公司)检测mRNA的表达水平。1)合成cDNA：取2 μl 总RNA，加入10×逆转录缓冲液1μl 、dNTP 1 μl 、随机引物0.5 μl 、RNA酶抑制剂0.25 μl 、AMV逆转录酶0.5 μl 、去RNA酶水配置总反应液体积为10 μl 。30 ℃ 10 min、42 ℃ 30 min、99 ℃ 5 min灭活逆转录酶。2)PCR反应：目的基因TH引物序列：上游5’AATTCGATTCCGACCTGGA 3’，下游5’RGATGTACTGGGTGCACTGGA3’，扩增目的片段398bp；以磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作为内参照物，GAPDH引物序列；上游5’GCGCCTGGTCACCAGGGCTGCTT 3’,下游5’TGCCGAAGTGGTCGTGGATGCCT3’，扩增目的片段465bp。引物由上海英骏生物技术有限公司合成。3)TH PCR反应体系：cDNA 10 μl 、5×PCR缓冲液 10 μl 、Tag酶0.25 μl ，目的基因及GAPDH上游、下游引物各0.5 μl ，加入双蒸水至总体积50 μl ，94 ℃预变性5分钟，扩增36个循环(条件：94 ℃变性30 s、57 ℃ 退火45 s、72 ℃延伸240 s、4 ℃5 min)。1.2%琼脂糖电泳分析PCR产物，应用UVIpro凝胶图像分析系统摄像并扫描分析，以目的基因与内参照物基因条带吸光度比值作为目的基因的相对表达强度。

1.5 统计分析

2 结 果

2.1 动物一般情况

在制作 MI动物模型过程中，心电图 I导联和aVL导联ST段上抬，部分动物 Ⅱ、Ⅲ和 aVF导联出现 ST段上抬，冠状动脉结扎线以下局部心肌搏动减弱，心肌颜色发紫。饲养过程中模型组、治疗组及假手术组动物均无死亡。模型组及治疗组二次开胸前心电图 I、 aVL 导联可见病理性Q波，假手术组心电图前后变化不大。开胸后在冠状动脉结扎附近梗死心肌呈现苍白色，而假手术组冠状动脉穿线附近心肌颜色无变化。经过 8 周的参松养心胶囊治疗后，治疗组心率较MI组有所下降(P<0.05，表1) 。

2.2 各组电生理参数

MI组较Sham组梗死灶周ERP明显延长(120.6±7.3 ms 比91.4±5.8 ms，P<0.01)。经参松养心胶囊干预8周后，SSYX组有效不应期有所缩短至105.1±6.7 ms。在程序电刺激试验中，MI组有2例(2/15，13.3%)诱发出VT，5例诱发出心室颤动(Vf)(5/15，33.3%)，室性心律失常(VA)总诱发率为46.7%。而SSYX组有1例(l/15，6.7%)诱发出VT，3例诱发出Vf(3/15，20.0%)，VA总诱发率为26.7%。VA总诱发率在SSYX组与MI组间有显著性差异(表 1)。

表1 各组间电生理数据比较

注：与Sham组相比，*P<0.01；与MI组相比，#P<0.05

2.3 各组TH mRNA的表达水平

术后8周 MI组梗死灶周及非梗死左室游离壁TH mRNA的表达水平分别为(3.176±0.099, 2.028±0.072)，较Sham组相应部位(0.958±0.051 , 0.960±0.054 ，P<0.01)显著增高。参松养心胶囊干预8周后，SSYX组相应部位TH mRNA的表达水平降低(1.768±0.113, 1.246±0.142)，与MI组比较有明显统计学差异(P<0.01，表2)。

表2 心肌TH mRNA表达水平

注：与Sham组相比，*p<0.01；与MI组相比，#p<0.05

3 讨 论

近年来大量研究证实MI时神经发生损伤变性，MI后慢性期存在神经鞘细胞和轴突再生及增生的动态演变过程，即神经重构。并且再生神经纤维大多数呈TH阳性，证实再生神经纤维以交感神经为主[9]。交感神经空间分布不均衡导致交感兴奋时心脏电生理异质性增加可促使恶性心律失常的发生[10]。

程序电刺激是评价MI后室性心律失常发生的重要指标，实验中我们通过程序电刺激检测MI后心肌电生理参数发现，MI组梗死灶周ERP明显延长，VA发生率增高。经参松养心胶囊干预后，SSYX组VA发生率降低。术后8周 MI组梗死灶周及非梗死左室游离壁TH mRNA的表达水平分较Sham组相应部位显著增高(P<0.05)。参松养心胶囊干预后，SSYX组相应部位TH mRNA的表达水平降低，有明显统计学差异。

MI后8周梗死灶周TH mRNA表达的增高说明梗死边缘区域TH活性较高，NE合成增多，与VA发生率增高相关。TH位于肾上腺素能神经的胞浆中，是NE生成的限速酶。交感神经的过度增生，使局部组织NE增高，梗死灶周高浓度NE作用于心肌细胞肾上腺素能受体，使离子通道发生重构，包括: Ica,L密度增加，复极 K+电流减低等，导致区域间电生理异质性增加和心肌组织重构，触发心律失常[1,3,11]。

现代药理学研究提示SSYX显著降低冠脉阻力和心肌耗氧量，对器质性心脏病和自主神经功能失调引起的室性早搏均具有显著疗效。SSYX作用于ICa，L、INa、Ito、IK多种离子通道，降低心肌细胞自律性，抑制折返激动，调节自主神经功能，多环节、多靶点抑制心律失常发生。李宁等[12]研究显示SSYX对IK电流有抑制作用。IK有快速激活(IKr)和缓慢激活(IKs)两种成分，心率增快时复极以IKs为主，SSYX阻滞心动过速时Iks，从而发挥抗心律失常作用。

总之，心肌梗死后心脏的交感神经重构增加了心肌对室性心律失常的易感性，参松养心胶囊干预可减低心肌梗死后的交感神经增生，从而降低室性心律失常的发生率。

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