胰岛素样生长因子-Ⅱ及基质金属蛋白酶-9与早期自然流产的相关性研究

张旭东 李 丽

(中国人民解放军第88医院妇产科，山东 泰安 271000)

早期自然流产(early spontaneous abortion,ESA)占自然流产的80%以上。病因主要有染色体异常、黄体功能不全、解剖因素、免疫功能异常、感染及环境因素等。此外,仍有40%～50%患者流产原因不明[1]。

妊娠是成功的半同种异体移植现象,胚胎植入是一个非常复杂而精细的生物学过程，受多种细胞因子的调节，涉及一系列的信号传导机制。正常情况下母体与胚胎间存在着复杂而特殊的免疫学关系，滋养细胞在母胎免疫耐受中起着关键作用，是母胎界面唯一与母体免疫系统直接接触的胎儿的外胚层抗原。胚胎植入过程中绒毛外滋养细胞侵袭力降低, 可引起子宫螺旋小动脉重塑异常、不能转化为低阻力血管,导致胎盘局部缺血缺氧,可能是造成早期自然流产的关键因素。

基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs) -9是细胞外基质降解过程中的限速酶。胰岛素样生长因子-Ⅱ(insulin-like growth factor-Ⅱ，IGF-Ⅱ)主要在绒毛小叶的合体滋养细胞、细胞滋养细胞及羊膜绒毛层内表达[2]。研究推测子痫前期发病中IGF-Ⅱ在滋养细胞合成和表达减少,使滋养细胞分泌MMP-9减少, 影响胎盘滋养细胞对螺旋小动脉的逆行浸润, 使胎盘血流量减少,绒毛间隙含氧量减少,造成绒毛细胞缺血缺氧，导致子痫的发生[3]。

本研究通过检测早期自然流产患者绒毛中IGF-Ⅱ及MMP-9的表达，旨在明确IGF-Ⅱ和MMP-9的关系及IGF-Ⅱ对MMP-9表达的影响，探讨MMP-9在IGF-Ⅱ作用下对基质金属蛋白酶的降解作用，进一步明确早期自然流产的原因。

1 资料和方法

1.1 研究对象及分组

1.1.1正常妊娠组 选取2011年3月至2011年10月因计划生育因素自愿到我院计划生育门诊人工流产的早孕妇女20例。标准:(1)年龄在20～35岁之间；(2) 月经规律，停经6～8周，彩超证实为宫内妊娠且见胚芽或胎心搏动；(3)妊娠前3个月及妊娠后未使用过甾体激素，本次妊娠期间无阴道流血、腹痛等先兆流产症状；(4) 无死胎、死产及自然流产史，排除子宫畸形、染色体、内分泌及解剖结构等方面的异常及自身免疫性疾病与生殖道感染。

1.1.2自然流产组 选取同一时间不明原因早期自然流产患者30例。标准:(1)年龄在20～35岁之间 ；(2) 月经规律，停经7～10周，两次彩超检查(间隔至少1周)均未见胎芽及原始心管搏动； (3)妊娠前3个月及妊娠后未使用过甾体激素；(4)排除绒毛染色体异常；(5)排除子宫畸形、感染及内分泌异常，夫妇染色体正常，既往无自身免疫性疾病。

1.2 材料和方法

1.2.1绒毛组织 无菌采集研究对象绒毛组织，约1 cm×1 cm×1 cm，生理盐水漂洗，置于冻存管内封存后-70℃储存待检，以提取组织总RNA。其余的绒毛组织用10%缓冲福尔马林固定，石蜡包埋，切片。

1.2.2引物序列 IGF-Ⅱ上游引物：5’- ACTCGGCCAGAGCGGCG-3’，下游引物：5’- GCACCAGCATCGACTTCCCCA- 3’；MMP-9上游引物：5’- GGTGGACCGGATGTTCCCCG-3’，下游引物：5’- CGCGCCAGTAGAAGCGGTCC-3’； GAPDH上游引物：5’-A CCACAGTCCATGCCATCAC-3’，下游引物：5’-TCCACCACCTGTTGCTGTA-3’(上海生工生物工程有限公司)。

1.2.3主要试剂及仪器 Trizol Reagent(Invitrogen公司)。Reverse Transcription System(TAKARA公司)。SYBR® Premix Ex TaqTM (Perfect Real Time) (TAKARA公司)。兔抗人IGF-Ⅱ单克隆抗体、羊抗人MMP-9多克隆抗体、SP-9001免疫组化染色试剂盒、SP-9003免疫组化染色试剂盒及DAB显色试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司。CFX 96型荧光定量PCR仪(Bio-Rad)，Nanodrop 2000型核酸分析仪(Thermo)，ABI 9700型PCR仪(ABI)。

1.2.4实验方法 (1)免疫组织化学染色：采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结(SP)法，实验步骤严格按照说明书进行。(2)实时荧光定量PCR：取50～100 mg组织放于液氮预冷的研钵中，加入液氮研磨成粉末。移入盛有1 ml Trizol 的1.5 ml无RNA酶EP管，严格按照说明书步骤提取总RNA。用核酸分析仪测定RNA样品浓度,测得OD 260/OD 280在1.8～2.0之间。1.5% agarose gel 2～4 μl RNA上样，电泳检测RNA完整性。按照逆转录试剂盒说明书步骤合成cDNA。PCR反应混合液总体积50 μl，包括subgreen mix (2×) 25μl、primer F(10 μM) 2 μl、primer R (10 μM) 2 μl、RT反应液(cDNA溶液)4 μl、dH2O(灭菌蒸馏水)17 μl冰上操作。设定以下PCR程序：95℃ 30秒，95℃ 5秒，60℃ 30～34秒共40个循环。绘制溶解曲线，计算△Ct值，进而计算2-△Ct。

1.2.5免疫组织化学染色结果判定 PBS代替一抗作为阴性对照。棕色或棕黄色颗粒沉着为阳性信号。在高倍镜下，每张切片随机选取5个视野，测定阳性信号的平均光密度。

2 结 果

2.1 实时荧光定量PCR检测结果

正常早孕组绒毛样品中可观察到IGF-Ⅱ和MMP-9的荧光定量PCR扩增曲线(图1)，说明IGF-Ⅱ及MMP-9基因在正常早期妊娠绒毛组织中均有表达。在早期自然流产组绒毛样品中也可观察到IGF-Ⅱ和MMP-9的荧光定量PCR扩增曲线(图2)，说明IGF-Ⅱ及MMP-9基因在早期自然流产组绒毛组织中均有表达，但与对照组相比，二者扩增量均减少，说明早期自然流产组IGF-Ⅱ及MMP-9基因表达减少。根据相对定量公式计算早期自然流产组患者绒毛组织中及正常早期妊娠组绒毛组织中IGF-Ⅱ mRNA、 MMP-9 mRNA的相对表达量，显示早期自然流产组绒毛组织的表达水平明显低于正常早期妊娠组(表1)，差异有统计学意义(P<0.05)。

图1 对照组IGF-Ⅱ和MMP-9的PCR扩增曲线

图2 实验组IGF-Ⅱ和MMP-9的PCR扩增曲线

组别nIGF-ⅡmRNAMMP-9 mRNA 正常早孕组 202.106±0.2460.281±0.052自然流产组300.632±0.2460.152±0.039t值20.24535.605P值0.00010.005

2.2 免疫组织化学染色结果

IGF-Ⅱ在正常早期妊娠绒毛组织的绒毛间质、绒毛小叶合体滋养细胞及细胞滋养细胞胞浆内弥漫性分布(图3)。早期自然流产组绒毛组织中IGF-Ⅱ阳性细胞数量较正常早期妊娠组减少，染色稍减弱(图4)。MMP-9在绒毛组织中的表达:MMP-9在正常早期妊娠组绒毛组织的绒毛小叶合体滋养细胞及细胞滋养细胞胞浆表达，间质中弱表达 (图5)。早期自然流产组绒毛组织中MMP-9阳性细胞数量较正常早期妊娠组减少，呈淡棕黄色(图6)。各组绒毛组织中IGF-Ⅱ的表达量:通过比较各组绒毛组织中IGF-Ⅱ的平均光密度值显示，早期自然流产组IGF-Ⅱ的平均光密度明显低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。各组绒毛组织中MMP-9的表达量:通过比较各组绒毛组织中MMP-9的平均光密度值(MOD)显示，早期自然流产组MMP-9的MOD明显低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。早期自然流产组患者绒毛组织中IGF-Ⅱ与MMP-9的直线相关分析:早期自然流产组绒毛组织中IGF-Ⅱ表达水平与相应部位的MMP-9表达水平呈正相关(r=0.491，P<0.05)。见图7。

图3 正常绒毛IGF-Ⅱ表达(×200)

图4 自然流产绒毛IGF-Ⅱ表达(×200)

图5 正常绒毛MMP-9表达(×200)

图6 自然流产绒毛MMP-9表达(×200)

图7 早期自然流产患者胎盘IGF-Ⅱ与MMP-9表达的关系

组别nIGF-Ⅱ平均光密度MMP-9平均光密度正常早孕组200.539±0.0200.464±0.061自然流产组300.271±0.0320.237±0.085t值33.30510.292P值0.00050.0001

3 讨 论

妊娠是成功的半同种异体移植现象, 母-胎免疫耐受的建立是保证胚胎不被母体免疫系统排斥的关键。 这种免疫耐受既发生在母-胎界面局部，也发生在母体外周。母-胎界面是一个非常复杂的免疫微环境，涉及多个免疫系统及调节因子，调节机制非常复杂、精细。

胚胎植入过程类似于肿瘤细胞浸润[4]，最基本的生物学过程是绒毛外细胞滋养层细胞向子宫内膜的迁徙、侵入。但与肿瘤细胞侵袭转移本质不同，滋养层细胞的侵袭过程受母体及胚胎产生的多种细胞因子调控，这种严格调控使滋养层细胞仅侵入子宫内膜及肌层内1/3，且在妊娠中期停止。滋养层细胞先通过其膜表面受体与其周围的ECM成分发生黏附，然后通过蛋白水解酶降解细胞外基质，同时滋养层细胞自身亦产生多种细胞外基质，形成新的外环境，以利于细胞迁移。这一过程中，蛋白水解酶起到重要作用。MMPs是细胞外基质降解过程中最重要的一类蛋白水解酶，在胚胎植入过程中起关键作用。

MMP-9属于基质金属蛋白酶系统中的明胶酶类，是滋养细胞侵入过程中的关键酶,它主要降解Ⅳ胶原及其他ECM,如胶原Ⅰ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ, 层黏连蛋白,纤维连接蛋白及玻连蛋白[5]。MMPs可能通过下列机制促进绒毛滋养细胞侵袭:①MMPs可直接发挥水解酶解的功能促进滋养细胞侵袭，作用于基底膜、蜕膜间质及血管腔面附着物，从而为滋养细胞侵袭清除了物理障碍。②可能与蜕膜细胞的凋亡有关。研究证明羊发育中的胎盘细胞凋亡与MMP、TIMP的关系为:凋亡大多发生在胎盘母胎界面顶端的细胞，这提示细跑外起支持作用的基质的降解可能启动蜕膜细胞的凋亡，有助于绒毛分支的形成[6]。③MMPs除了直接作用于细胞外基质的主要成份外，还可以作用于其他蛋白而发挥其潜在的生物学作用，如MMP-1、MMP-2、MMP-3可降解胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP-3、IGFBP-5)，而间接使游离IGF水平增加[7]。

滋养细胞的侵入受到高度精确的调控，主要表现在时间上限制在妊娠早期，空间上限制在内1/3子宫浅肌层。这种高度精确的调控机制依赖于促浸润与抑浸润因素两者的共同作用，二者之间的动态平衡既满足妊娠的生理要求又未超出正常限度。如果这种平衡被破坏，将导致病理妊娠的发生，如滋养细胞浸润不足会导致自然流产、先兆子痫、胎儿生长受限等病理妊娠；如浸润过度则导致滋养细胞肿瘤。多项研究表明自然流产绒毛滋养细胞MMP-9、MMP-2呈低表达[8-9]。

本研究采用免疫组化及实时荧光定量PCR技术检测妊娠7～10周自然流产患者绒毛组织中的MMP-9 mRNA及蛋白表达，与对照组比较表达明显降低，与以往报道结果相符，提示MMP-9表达降低，导致滋养细胞降解细胞外基质能力下降，浸润能力减弱，绒毛侵入不足，最终导致流产。

IGF-Ⅱ又称生长调节素A，含67个氨基酸残基，分子量约为6.7 kDa，属小分子多肽。人早孕绒毛滋养层细胞中IGF-ⅡmRNA阳性表达率为100%，在羊膜绒毛层内、绒毛小叶的合体滋养细胞、细胞滋养细胞中均有IGF-II表达[10]。

IGFs 是体内重要的生长因子，通过自分泌、旁分泌等方式对组织细胞的增殖、分化、凋亡、机体的生长发育及肿瘤的发生发展起重要的调节作用。孕卵的着床是一个非常复杂而调节精细的生理过程，有许多生长因子及其受体参与，而且这些生长因子对胚胎的发育、囊胚生成的比例、囊胚细胞数、新陈代谢和凋亡都有影响，IGFs是其中之一。胚胎着床的各个环节中都有IGFs的参与调节，体外培养证实添加IGF-Ⅱ对小鼠胚胎发育具有一定的促进作用[11]。

孕卵着床的过程中许多生长因子可上调滋养细胞MMPs的合成与分泌，其中最重要的一种即为IGFs。Irwind等[12]发现IGFs可以促进滋养细胞分泌MMP，进而加强滋养细胞的侵袭功能。在细胞滋养层的滋养细胞上IGF-Ⅱ mRNA呈梯度样表达，在侵入的前缘部分IGF-Ⅱ mRNA表达最高，提示其在接触中起作用。本研究免疫组织结果显示IGF-Ⅱ在正常早期妊娠组绒毛组织中的合体滋养细胞及细胞滋养细胞均有表达，且均比自然流产组表达增加，说明其对绒毛的侵入具有促进作用,与以往研究相符。

研究表明自然流产患者IGF-Ⅱ呈低水平表达，本研究采用免疫组化及实时荧光定量PCR技术检测早期自然流产患者绒毛组织中的IGF-Ⅱ，与对照组比较，呈低水平表达，与以往研究相符。

MMPs是滋养细胞分泌的唯一有效水解酶[13]，如分泌减少将影响其对细胞外基质的降解，进而影响滋养细胞对子宫肌层的浸润和血管重铸。本实验表明，早期自然流产组绒毛组织中MMP-9表达明显低于对照组，说明MMP-9减少可能影响绒毛滋养细胞侵入能力，导致自然流产；同时早期自然流产组中IGF-Ⅱ表达明显低于对照组，且二者在绒毛组织中相应部位的mRNA及蛋白质表达均呈正相关，提示二者可能共同参与了自然流产的病理过程，绒毛中IGF-Ⅱ及MMP-9含量下降可能导致滋养细胞降解细胞外基质能力下降，侵入子宫螺旋小动脉能力不足，造成胎盘浅着床，从而导致自然流产。

总之，我们的实验结果显示，与正常早期妊娠相比，早期自然流产组绒毛组织中IGF-Ⅱ及MMP-9均呈低表达，且二者mRNA、蛋白质水平均呈正相关。提示IGF-Ⅱ及MMP-9可能共同参与了自然流产的病理过程，是导致自然流产的原因之一,但二者的具体作用机制尚待进一步研究证实。

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