微管相关蛋白Tau mRNA在胃癌中的表达及临床意义

张德力，徐贝贝，李春辉

(1.承德医学院，河北承德 067000;2.承德医学院附属医院)

胃癌是我国常见恶性肿瘤之一，在我国的发病率居各类肿瘤的首位，但其发病机制目前尚未明确[1]。微管相关蛋白(MAP）是与微管结合的非微管结构蛋白，目前已发现和提纯的MAP主要有MAP-1、MAP-2、MAP-4和Tau等，它们参与微管的组装、维持微管的稳定和微管与其它骨架纤维间的连接[2]。Tau蛋白为微管聚合蛋白，是细胞骨架的重要成分，其与微管结合能诱导微管成束，增强微管的稳定性。当细胞骨架发生异常变化时，可使细胞黏附能力下降、运动能力增强，引起细胞的恶性转化从而导致肿瘤的发生。Tau还是有丝分裂期纺锤体的主要成分，可使肿瘤细胞的细胞周期顺利进行，为肿瘤细胞的无限增殖提供条件，加速恶性肿瘤的进展[3]。本研究对Tau mRNA在胃癌中的表达及与胃癌临床病理特征的关系进行了探讨。

1 材料与方法

1.1 临床资料 承德医学院附属医院2008年12月至2010年3月手术切除经病理证实为胃癌的组织标本60例及正常胃组织(距离肿瘤10cm以上）10例，取材后迅速投入液氮中保存。60例胃癌患者，男49例、女11例，年龄43-77岁，平均(58.3±10.0）岁;高中分化者28例、低分化者32例，无淋巴结转移者25例、有淋巴结转移者35例，Ⅰ+Ⅱ期32例，Ⅲ+Ⅳ期28例。10例正常胃组织，男6例、女4例，年龄45-70 岁，平均(59.5±5.0）岁。

1.2 试剂与仪器 Trizol，美国Invitrogen公司;异丙醇、乙醇、琼脂糖，北京化学试剂公司;AMV反转录试剂盒，上海生工生物工程技术服务有限公司;PCR扩增试剂盒、50bp DNA Ladder，北京天根生化有限公司;溴化乙锭(EB)，美国Promega公司。超速离心机，美国Sigma公司;Bio-mini紫外分光光度计，日本岛津公司;PCR扩增仪，美国Research公司。

1.3 RT-PCR检测Tau mRNA的表达 取100mg液氮中保存胃癌组织或正常胃组织，按Trizol总RNA抽提说明书操作，提取胃癌组织或胃组织的总RNA。取1μl RNA，含EB的1%琼脂糖凝胶电泳检测所提取的RNA是否完整后，紫外分光光度计分别测定230nm、260nm、280nm波长处的OD值，计算OD260/OD280，确定RNA的纯度及浓度。取1000ng总RNA为模板逆转录成cDNA，反应条件为25℃，10min;37℃，50min;70℃，15min;4℃，5 min。

RCR反应引物序列:Tau上游引物(5’→3’)为GTG ACC CAA GAG CCT GAA AGT，下游引物(5’→3’)为GGT GCA GGT CTC CTA GAA GC;PCR反应条件:95℃预变性5min，95℃变性45s、69℃退火45s、72℃延伸30s、循环40次，72℃最终延伸10min结束反应。β-actin上游引物(5’→3’)为CAT GTA CGT TGC TAT CCA GGC，下游引物(5’→3’)为CTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT;反应条件:95℃预变性5min，95℃变性45s、58℃退火45s、72℃延伸30s、循环31次，72℃最终延伸10min结束反应。取10μl PCR产物1.5%琼脂糖凝胶电泳，紫外荧光数字成像仪摄像并进行光密度定量分析，以Tau与β-actin扩增产物条带累积光密度(IOD)的比值作为Tau mRNA的相对表达水平。

1.4 统计分析 采用SPSS 11.5统计软件，计量资料用(±s）表示，采用两独立样本t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 正常胃组织与胃癌组织Tau mRNA的表达 胃癌组织Tau mRNA的表达为(0.78±0.08），明显高于正常胃组织(0.53±0.01），差异具有统计学意义(P＜0.05）。

2.2 胃癌组织Tau mRNA的表达与胃癌临床病理特征的关系 见附表。不同年龄、性别和肿瘤长度胃癌Tau mNA的表达比较差异无统计学意义(P＞0.05）。胃癌组织Tau mRNA的表达与胃癌分化程度、有无淋巴结转移和TNM分期有关(P＜0.05）:低分化胃癌Tau mRNA的表达明显高于高中分化胃癌，有淋巴结转移者Tau mRNA的表达明显高于无淋巴结转移者;TNM Ⅲ+Ⅳ期者Tau mRNA的表达明显高于Ⅰ+Ⅱ期者。

附表 Tau mRNA在胃癌中的表达及与胃癌临床病理特征的关系(n=60）

3 讨论

MAPs分子至少包含一个结合微管的结构域和一个向外突出的结构域。MAPs包括Ⅰ型和Ⅱ型两大类:Ⅰ型对热敏感，如MAP1a、MAP1b，主要存在于神经细胞中;Ⅱ型热稳定性高，包括MAP2a、b、c，MAP4和Tau蛋白[4]。MAP的主要功能是促进微管聚集成束、增加微管的稳定性和强度以及促进微管组装。不同微管间的差异，主要与结合于微管上的非微管结构蛋白有关[5]。已有人发现将Tau基因转染入正常并不表达Tau蛋白的细胞，在转染的细胞中，Tau蛋白与微管结合或诱导微管成束，从而增加微管的稳定性[6]。研究表明，肿瘤组织Tau表达增加可导致肿瘤的加速生长，促进肿瘤的发生发展。以往关于Tau蛋白的研究多集中在神经系统[6-8]，在胃癌中的研究较少。Tau蛋白作为有丝分裂期纺锤体的主要成分，可使细胞周期顺利进行，为癌细胞无限增殖提供条件[9-10]。

本研究结果显示胃癌组织Tau mRNA的表达明显高于正常胃组织、低分化胃癌明显高于高中分化胃癌、有淋巴结转移者明显高于无淋巴结转移者、TNM Ⅲ+Ⅳ期胃癌明显高于Ⅰ+Ⅱ期胃癌，提示胃癌组织Tau mRNA的表达水平出现异常，与肿瘤的分化程度、有无淋巴结转移和肿瘤侵袭密切相关。

本研究对正常胃组织及胃癌组织Tau mRNA的表达进行了研究，对了解胃癌的发生机制及判断预后均具有重要的参考意义。同时，随着微管性质和功能不断被阐明，微管作为抗肿瘤药物研究的一个热门靶点，必定会发现更多的有显著抗肿瘤作用的微管抑制剂。

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