污水处理活性污泥微生物群落多样性研究

金浩，李柏林，欧杰，陈兰明*

(1.上海海洋大学食品学院，上海201306;2.上海海洋大学，上海201306)

活性污泥法是工业化国家最常见的污水生物应用处理技术。用于处理生活废水及工厂污水的活性污泥成分复杂，不仅有来自于污水的难降解有机物，被污泥絮体吸附的无机物，还包括有代谢功能的活性微生物群体，微生物内源呼吸和自身氧化的残留物。能降低污水中复杂成分的材料是一种生物性的絮状材料，主要有腐生性营养细菌、原生动物和细胞外高分子物质(EPS)［1］。微生物不仅参加一些小分子细胞新陈代谢，而且通过酶的水解作用使得大部分大分子有机物通过一系列的水解反应变成可被细菌细胞吸收系统吸收的较小单位的物质。而这些未知的微生物蕴含着一个宝贵的有可能获得新酶的潜在资源。近年来，宏基因组技术已经成功地应用在从各种环境中的未培养微生物中获得新型微生物产物［2］。本研究通过非培养宏基因组技术研究位于中国上海污水处理系统中活性污泥的多样性。要在如此复杂的样品中获得较为纯净且完整度高的DNA具有一定难度。本实验宏基因组DNA的提取方法是根据Zhou J等［3］提出的原位提取法并做了一些修改，以保持环境样品中DNA的完整性和纯度，并通过16S rDNA PCR来验证活性污泥宏基因组DNA的细菌多样性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品采集样品来自污水处理工厂(处理工业和市政废水，上海)，用无菌采样袋装盛并密封，立即存于冰盒运至实验室。

1.1.2 主要试剂DNA提取缓冲液:Tris-HC1 100 mmol/L，EDTA 100 mmol/L，NaCl 1.5 mol/L和1%(质量体积比)溴化十六烷基三甲基铵(Sigma-Aldrich，美国)，pH 8.0;Premix Ex Taq，购自上海生工生物有限公司;Axygen DNA凝胶回收试剂盒，购自爱思进生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 活性污泥宏基因组DNA的提取活性污泥总DNA具体的提取方法如下:取活性污泥样品50 g和135 mL的DNA提取缓冲液加入到150 mL离心管中，置于37℃充分混合0.5 h。然后加入0.5 mL蛋白酶K和2.0 mL 20%SDS溶液，置于50℃水浴反应3 h，并每20 min上下颠倒混匀。在25℃下6 000 r/min离心10 min，收集上清液，然后加入等体积氯仿/异丙醇(24∶1)混合液，上下颠倒混匀后，4℃，12 000 r/min离心10 min，吸取含有DNA的上层水相。向水相中加入0.1倍水相体积3 mol/L醋酸钠(pH 5.3)和2倍水相体积无水乙醇，上下颠倒混匀30 s，放在-20℃2 h。然后4℃，13 000 r/min离心15 min。去掉上清液，加入2 mL 70%乙醇洗涤，洗掉酒精并晾干。用200 μL Mili-Q无菌水溶解宏基因组DNA，-20℃保藏。

1.2.2 宏基因组DNA纯化及浓度测定通过割胶回收对DNA进行纯化处理，方法参照Axygen DNA凝胶回收试剂盒，回收的宏基因组DNA的浓度通过SAM1000分光光度计进行测定。

1.2.3 16S rDNA PCR扩增DNA的提取质量通过进行细菌16S rDNA PCR。PCR反应体积为20 μL，反应体系为DNA模板1 μL，Premix Ex Taq 1 μL，上下游引物各0.5 μL，ddH2O添至总体积为20 μL。16S PCR的通用引物为27F和1492R，上游引物27F:5＇-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3＇，下游引物1492R:5＇-GGTTACCTTGTTACGACTT-3＇。PCR反应条件:最初变性温度的95℃5 min;随后94℃变性30 s，58.3℃退火30 s，72℃延伸90 s，30个循环;最后72℃延伸10 min。PCR产物的检测是通过1%的琼脂糖凝胶电泳。PCR产物经过割胶回收纯化。

1.2.4 16S rDNA文库的建立纯化后的PCR产物与pGM-T载体(TaKaRa中国大连)连接，连接产物转化到TOP10感受态细胞(上海生工生物有限公司)中，涂布于表面加入16 μL的IPTG(50 mg/mL)、40 μL X-gal(20 mg/mL)的LB(Amp+)固体培养基上，随机挑取阳性克隆于LB(Amp+)液体培养基中，提取质粒并送上海生工生物公司测序。

1.2.5 系统发育树的建立将16S rDNA的核苷酸序列与NCBI数据库进行Blast比对，并获得相似种属。序列以FASTA格式输入BioEdit，并用Clustal W2功能进行比对。比对结果输入分析软件MEGA4(version 4.0)中，激活后进行neighborjoining建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 活性污泥的宏基因组DNA提取

直接法提取到的DNA呈深褐色并伴有大量絮状物，说明DNA粗提液中仍然包含着各种一同抽提出来的色素或其他杂质。

图1 活性污泥宏基因组DNA电泳结果Fig.1 Agarose gel electrophoresis analysis of metagenomic DNA extracted from activated sludge sample M:λDNA/HindⅢladder;1～3:提取的宏基因组DNA M:λDNA/HindⅢladder;1～3:Metagenomic DNA extracted

由图l可知，提取的DNA片段大约23.1 kb，电泳拖尾现象严重，说明DNA纯度不高。条带亮度高说明DNA提取量很高。经过割胶纯化后，DNA纯度提高，片段大小几乎没有改变。

2.2 16SrDNA PCR克隆文库建立

以活性污泥总DNA为模板扩增得到约1.5 kb的16S rDNA产物，与预期片段大小相符。

测序共获得195条高质量16S rDNA序列，通过Blast程序进行比对检索，并构建系统发育树，如图2，得到与序列最相似的细菌种类。比对结果表明，活性污泥16S rDNA克隆文库与GenBank数据库中的同源序列均来自于环境样品，与Gen-Bank数据库中已知16S rDNA序列的相似性均高达97%以上。

图2 16SrDNA克隆文库的系统发育树图Fig.2 Phylogenetic tree of deduced carboxypeptidase amino acid sequences obtained from microbial community of activated sludge samples

195个克隆中，变形菌门是最明显的优势类群。包括β-变形菌门(β-Proteobacteria)中产碱杆菌属Alcaligenes(107个克隆)、Aquabacterium(1个克隆)、Oxalicibacterium(1个克隆)、Massilia(1个克隆)、Comamonas(1个克隆);γ-变形菌门(γ-Proteobacteria)中Oceanimonas(3个克隆)、Oceanisphaera(1个克隆)、Enterobacter(3个克隆)、Vibrio(6个克隆)、Pseudomonas(25个克隆)、Acineto-bacter(2个克隆)、Xanthomonas(3个克隆)、Stenotrophomonas(25个克隆)。其余克隆子鉴定到菌属水平的包括:厚壁胞门(Firmicutes)中芽胞杆菌属Bacillus(4个克隆)、肠球菌属Enterococcus(4个克隆)、漫游球菌属Vagococcus(1个克隆);拟杆菌门(Bacteroidetes)中Myroides(4个克隆);硝化螺菌门(Nitrospirae)中Candidatus Nitrospira defluvii(2个克隆);绿弯菌门(Chloroflexi)中Herpetosiphon(1个克隆)。

3 讨论

宏基因组DNA的提取是研究活性污泥样品的第一步，DNA的提取包含DNA产量、DNA纯度和DNA对整个微生物群落的代表性等方面。本实验研究对象为活性污泥样品，其复杂的物理特性及物质成分无法用现有的试剂盒提取DNA，因此选择直接法对样品进行提取宏基因组DNA。根据Zhou J等提出的原位提取法，抽提的宏基因组DNA电泳图显示出本实验的提取方法可以获得较高浓度且保持较大长度的DNA片段，同时DNA粗提液颜色呈黄褐色，仍包含很多杂质，需要进一步纯化。

污水处理活性污泥16S rDNA文库中的克隆Blast比对结果显示，与GenBank数据库的最相似序列基本来自于环境样品，文库中的序列与已培养细菌的16S rDNA序列相似性高于97%，即鉴定到菌属。结果表明，污水处理活性污泥的微生物以变形菌门、厚壁菌门和拟杆菌门为主。本研究还在活性污泥中发现了绿弯菌门和硝化螺菌门细菌类群。这些结果说明，污水处理活性污泥中微生物种类非常丰富，且部分克隆子与GenBank数据库中未培养的环境细菌序列最相似，若单纯利用传统的培养方法对活性污泥菌群进行研究是不充分的。16S rDNA克隆文库方法为活性污泥细菌多样性提供一个更加全面的认识，对细菌进行功能研究有极大帮助，包括特定培养基的设定以及相关基因序列的搜索。但对活性污泥的真核生物多样性研究则需建立18S rDNA文库。

本研究的16S rDNA克隆比对结果显示出3个较优势的菌属。近55%的克隆与Alcaligenes feacalis相似性高达99%，产碱杆菌属存在于各种环境中并可以分泌蛋白酶［4］、几丁质酶［5］、腈水解酶［6］等，对污水中的有机质有水解作用，其硝化作用也可将污水中的氮元素降解为N2O或N2［7］。与25个克隆相似度为98%的优势菌为Pseudomonas aeruginosa，假单胞菌是一种广泛分布于自然界的常见的病菌，是自然界中碳、氮循环的重要一环［8］，分解蛋白质和酯酶能力很强［9］。同样有25个克隆与已知序列相似性高达99%的菌为Stenotrophomonas sp.，Stenotrophomonas sp.最初被分作假单胞菌属，后被确认为寡养单胞菌属，寡言单胞菌同样有很强的产蛋白酶能力［10］和产酯酶能力。亚硝酸盐氧化细菌Candidatus Nitrospira defluvii，是一个在处理工业污染和废水的生物污水处理系统中［11］重要的硝化细菌。W35序列显示了与Comamonas的98%的相似之处，这种菌被普遍发现在源于城市和工业废水处理厂的活性污泥样品［12］。另外还有自然的清道夫之称的Herpetosiphon aurantiacus［13］，W33相似度为99%。这类细菌曾出现在污染水体中，说明它们可能在活性污泥中对污水处理过程发挥重要的生物处理功能。

同时，Alcaligenes feacalis是机会致病菌［14］，可以引起败血症、婴儿脑膜炎等。Pseudomonas是一种致病力较低但抗药性强的杆菌［15］，常见于伤口感染，也能产生多种与毒力相关的物质，如外毒素a。

本研究通过16S rDNA克隆文库方法初步分析了污水处理活性污泥中微生物群落的多样性。研究发现活性污泥中微生物种类很丰富，包括可能执行很复杂的污水生物处理功能的微生物;同时，活性污泥中也存在着极多的细菌病原体。

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