EMA－LAMP方法快速检测鉴别副溶血性弧菌

金雪花，吕淑霞，张超，徐彬，于晓丹

(沈阳农业大学生物科学技术学院，辽宁沈阳110866)

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus，VP)是一种常见肠道致病菌，其污染会给海水养殖业带来严重损失，还会引起人类腹泻等肠道疾病及食物中毒，出现腹泻、腹部痉挛、恶心、呕吐和头痛等症状［1］。自2001年以来，副溶血弧菌性食物中毒爆发已经成为中国最常见的食源性疾患。随着人们对食品安全性要求的不断提高，对细菌的“活的非可培养状态”(Viable but non-culturable state，VBNC)进行检测研究的实际意义越来越明显。常规的基于分子水平检测病原菌的方法以其具有快捷、灵敏、特异性强等优点已用于副溶血性弧菌及其他致病菌的检测研究［2］，但是其缺点在于不能区分所检测到的病原菌是活细胞还是死细胞，而且由于需要精密度高的仪器而限制了其在现场和基层单位的应用［3］。近年来环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)以其高效、灵敏、操作方便等优点，使其在食源性致病菌以及病毒的检测中得到了重要的应用［4-6］。LAMP检测法无需精密度高的仪器，仅需在恒温条件下便可完成核酸扩增反应［7］，是一种可实现现场和基层单位应用的方法。Thidium Bromide Monoazide(EMA)作为一种DNA结合染料，易光解形成氮宾化合物且能渗透到细胞壁(膜)不完整的菌体内，与DNA分子不可逆的共价结合，从而抑制死细胞的DNA扩增。因此，EMA与PCR、LAMP结合检测鉴定副溶血性弧菌的死/活细胞具有一定的可行性。目前，已有EMA与PCR、LAMP相结合，成功抑制死细胞的扩增且对混合菌中活细胞进行定量检测的报道［8-10］。本试验将具有选择渗透性的EMA与高效、灵敏的LAMP相结合，在纯培养条件下，对副溶血性弧菌的死/活菌细胞进行检测及鉴别，从而建立了EMA-LAMP检测法，并将此方法与EMAPCR法进行了比较。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus，ATCC 17802)购自北京中国药品生物制品检定所。

1.1.2 主要试剂LAMP体系有关试剂:Bst DNA聚合酶(8 U/μL)、1×ThermoPol buffer Biolabs;Betaine Fluka;MgSO4;PCR体系有关试剂:Taq DNA聚合酶(5 U/μL)、dNTPs、10×Buffer(含1.5 mmol/L Mg2+)、LoadingBuffer TAKARA公司;DL1000 DNA Marker、DL5000 DNA Marker上海生物工程有限公司;5×TBE电泳缓冲液:称取Tris 54.0 g、硼酸27.5 g，并加入0.5 mol/L EDTA(pH 8.0)20.0 mL，定容至1 000 mL。用时稀释到1.0×TBE电泳缓冲液(pH 8.3);EB母液:将EB配制成10.0 mg/mL，用铝箔或黑纸包后贮于室温，使用前稀释;EMA母液:无菌水溶解EMA，配制成1.0 mg/mL母液，用锡箔纸包裹置于－20℃备用。

1.1.3 主要仪器恒温水浴锅，国华电器有限公司;PCR仪，TECHNE公司;JY600C型电泳仪，北京君意东方电用仪器有限公司;凝胶成像系统，伯乐公司;移液枪，Eppendorf;500W卤钨灯，沈阳艺沈器化玻站。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成根据GenBank公布的副溶血性弧菌tlh基因序列(Accession number:AY 289609)中的保守序列，运用引物设计软件(Primer Explorer V4)在线进行LAMP引物设计，设计1套引物，包括2条外引物F3、B3，2条内引物FIP、BIP和2条环引物LF、LB。为了更有好地进行EMA-PCR与EMA-LAMP法检测副溶血性弧菌的优劣对比，本文用LAMP反应中的1对外引物F3、B3分别作为PCR扩增反应中的上游引物和下游引物参与反应，PCR扩增片段为231 bp。以上引物由TAKARA公司合成。引物序列见表1。

表1 扩增tlh基因的LAMP引物序列Table 1 Sequences of LAMP primers for specific amplification of the tlh gene(Accession number:AY289609)

1.2.2 DNA模板制备TZ法［11］:取0.5 mL对数期菌悬液与等体积的2×TZ的细胞裂解液混匀，沸水浴10 min后冷却到室温，10 000 r/min离心5 min去掉沉淀，取上清液备用;TZ裂解液配置:2.0%Triton X-100，2.5 mg/mL的叠氮化钠，0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液，pH 8.0。

1.2.3 热处理杀死副溶血性弧菌取10.0 mL 37℃培养至对数生长期的副溶血性弧菌菌悬液，用无菌的胰胨肉汤稀释，使菌浓度为1.0×108cfu/mL。取以上处理的0.5 mL菌悬液于1.5 mL离心管中，参考祝儒刚等［1］的研究，直接将菌悬液在95℃水浴处理10 min，待菌悬液冷却至室温，涂平板，置于37℃培养箱中培养24 h，观察计数。

1.2.4 不同浓度EMA对死菌细胞DNA扩增的影响取0.5 mL浓度为1.0×108cfu/mL的热致死的副溶血性弧菌菌悬液，加入浓度为0.1 μg/μL的EMA试验用液，使EMA终浓度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 μg/mL，混匀并于黑暗下室温放置5 min后放在冰浴上，每5 min补充1次碎冰块，距500 W卤钨灯16 cm，根据文献［12］暂定曝光时间为30 min。然后10 000 r/min离心10 min，弃上清，加入0.5 mL生理盐水，再10 000 r/min离心10 min，弃上清后加入0.5 mL无菌水。按照1.2.2中的方法抽提DNA进行LAMP和PCR扩增检测。

1.2.5 不同浓度EMA对活菌细胞DNA扩增的影响取0.5 mL浓度为1.0×108cfu/mL的副溶血性弧菌活细胞菌悬液，加入浓度为0.1 μg/μL的EMA试验用液，使EMA终浓度分别为0、2、4、6、8、10、20、40、60、80、100 μg/mL，混匀并于黑暗下室温放置5 min，进行光照及光照后处理，同上。然后，按照1.2.2中的方法抽提DNA进行LAMP和PCR扩增检测。

1.2.6 EMA最佳曝光时间的确定取0.5 mL热致死的副溶血性弧菌菌悬液(浓度为1.0×108cfu/mL)加入8个1.5 mL离心管中，每管加入浓度为0.1 μg/μL的EMA试验用液，使其终浓度为上述优化好的最小抑制死细胞扩增的浓度，混匀并于黑暗下室温放置5 min，然后将离心管开盖放置冰上，距离500 W卤钨灯灯管16 cm，分别进行0、1、5、10、15、20、25、和30 min的光照，每5 min补充1次冰，防止温度升高。光照后处理同上。然后，按照1.2.2中的方法抽提DNA进行LAMP和PCR扩增检测。同样方法取活菌菌悬液进行EMA-LAMP和EMA-PCR作为对照。

1.2.7 EMA-LAMP和EMA-PCR扩增混合菌中活菌细胞DNA的比较试验分3组进行对照分析。A组为0.25 mL热杀死细胞菌悬液(1.0×108cfu/mL)混合于0.25 mL经无菌胰胨肉汤10倍比例稀释的活细胞菌悬液(1.0×108～1.0×100cfu/mL)中，进行LAMP和PCR扩增。阳性对照为0.5 mL含有1.0×108cfu/mL的活细胞菌悬液;B组为0.25 mL经无菌胰胨肉汤进行10倍比例稀释的活细胞菌悬液(1.0×108～1.0×100cfu/mL)分别混合于0.25 mL无菌水，进行LAMP和PCR扩增。阳性对照同上;C组为0.25 mL活细胞菌悬液(1.0×108cfu/mL)混合于0.25 mL经无菌胰胨肉汤10倍比例稀释的不同浓度(1.0×108～1.0×100cfu/mL)的热杀死菌细胞悬液中。进行LAMP和PCR扩增。阳性对照同上。以上3组分别加入EMA溶液，使其终浓度为最小抑制死细胞扩增的浓度，黑暗下室温放置5 min后，进行光照及光照后处理。然后，按照1.2.2中的方法抽提DNA进行LAMP和PCR扩增检测。

1.2.8 LAMP反应体系及反应条件MgSO42 mmol/L，dNTPs 1.0 mmol/L，betaine 1.0 mol/L，内引物(FIP和BIP)各1.6 μmol/L，外引物(F3和B3)各0.2 μmol/L，环引物(LF和LB)各0.8 μmol/L，Bst DNA聚合酶大片段(8 U/μL)0.8 μL，1×ThermoPol Reaction buffer 2.5 μL，DNA模板1 μL，补水至反应体系25 μL;混匀，于63℃温育30 min，80℃灭活10 min，冰浴2 min。

1.2.9 PCR反应体系及反应条件配制PCR反应体系:dNTPs 0.8 mmol/L，引物各0.8 μmol/L，TaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.2 μL，10×buffer(含Mg2+)2.5 μL，DNA模板2.0 μL，补水至反应体系25.0 μL。;反应条件:预变性94℃，3 min;然后按94℃，1 min，59℃，1 min，72℃，2 min循环30次;最后1个循环结束后，72℃延伸10 min，4℃保存。

1.2.10 扩增产物分析取5 μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳(凝胶浓度1%，电压100 V)，电泳后用溴化乙锭染色及UVI凝胶成像系统观察分析结果。

2 结果与分析

2.1 不同方法提取DNA的LAMP扩增

图12 种方法提取模板DNA的LAMP扩增Fig.1 Two methods of DNA extraction for amplification by LAMP(A，B)M:DL1000 Marker;1:阴性对照;2:煮沸法提取DNA;3:TZ法提取DNA

按照1.2.2中的方法提取DNA，进行LAMP扩增，结果见图1。从图1中可以看出，2种方法提取的DNA进行LAMP扩增后，扩增结果并无明显区别。因此，在之后的试验中，选择简便、快捷、成本低的煮沸法提取DNA。

2.2 热处理杀死副溶血性弧菌

将浓度为1.0×108cfu/mL的副溶血性弧菌活细胞放入95℃水浴10 min做热杀死处理，经平板培养计数得:在此条件下可以完全杀死菌此浓度的副溶血性弧菌活细胞。

2.3 不同浓度EMA对死菌细胞DNA扩增的影响

设定EMA的浓度为0、0.2、0.4、0.6、0.8、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 μg/mL。由图2A可知，当EMA浓度为6.0 μg/mL时，LAMP扩增结果仍有非常隐约的条带产生，而当其浓度大于等于8.0 μg/mL时，无条带产生，说明LAMP扩增被抑制;由图2B可知，当EMA浓度小于等于2.0 μg/mL时，PCR扩增条带亮度随EMA浓度的增加而减弱，浓度大于等于4.0 μg/mL时，无条带产生，说明PCR扩增被抑制。

图2 不同浓度EMA对死菌DNA扩增的影响Fig.2 Effect of the different concentration of EMA on amplification of DNA from heat killed bacterial cells

2.4 不同浓度EMA对活菌细胞DNA扩增的影响

设定EMA的浓度为0、2、4、6、8、10、20、40、60、80、100 μg/mL。由图3A可知，扩增条带并未随着EMA浓度的增加而减弱，而是呈现出亮度几乎无差别的情况，说明不同浓度的EMA对活菌细胞DNA进行LAMP扩增无影响，或者影响不大;由图3B可知，当EMA浓度小于等于20 μg/mL时，PCR扩增条带亮度随EMA浓度的增加而有所减弱，当EMA浓度达到40 μg/mL以上时，无条带产生，说明高浓度EMA对活菌细胞DNA的PCR扩增有抑制作用。

2.5 EMA最佳曝光时间的确定

根据2.3和2.4的优化结果，此处的试验选择加入EMA的浓度为最小抑制副溶血性弧菌死细胞的EMA浓度，即8.0 μg/mL。从图4A、B、C、D可以看出，经此浓度的EMA处理后的活菌，无论曝光多长时间，对LAMP和PCR扩增均无影响;经此浓度的EMA处理后的死细胞，曝光时间为20 min时，PCR便没有扩增条带，而LAMP仍有扩增条带，虽然条带亮度有所减弱，仍可说明没有完全抑制LAMP扩增;当曝光时间大于等于25 min时，PCR与LAMP对死细胞的扩增结果为均无扩增条带产生。表明，无论应用哪种方法对副溶血性弧菌死/活细胞进行检测鉴定，EMA光解时间超过25 min，便能够达到区分死/活菌细胞的目的。

图3 不同浓度EMA对活菌DNA扩增的影响Fig.3 Effect of the different concentration of EMA on amplification of DNA from viable bacterial cells

图4 EMA激活光解的最佳曝光时间的确定Fig.4 Determination of light exposure time to activate and photolyse EMA

2.6 EMA-LAMP和EMA-PCR扩增混合菌中活菌细胞DNA的比较

3组EMA-LAMP扩增试验结果见图5A、C、E;3组EMA-PCR扩增试验结果见图5B、D、F。结果表明，0.25 mL热杀死细胞菌悬液(1.0×108cfu/mL)混合于0.25 mL经无菌胰胨肉汤进行10倍比例稀释的活细胞菌悬液(1.0×108～1.0×100cfu/mL)的扩增结果，与经上述相同处理的活细胞菌悬液分别混合于0.25 mL无菌水的扩增结果基本一致，扩增条带的亮度随着活菌数量的减少而减弱(图5A、C;B、D)。而且，从图5A中可得EMA-LAMP的检出限为1.0×102cfu/mL，从图5B中可得EMA-PCR的检出限为1.0×105cfu/mL，说明EMA-LAMP检测灵敏度要高于EMA-PCR。图5E、F为0.25 mL活菌细胞悬液(1.0×108cfu/mL)混合于0.25 mL经无菌胰胨肉汤进行10倍比例稀释的热杀死细胞菌悬液(1.0×108～1.0×100cfu/mL)中进行LAMP和PCR扩增的结果。从图5可以看出，LAMP与PCR扩增条带的亮度并无明显区别，表明不同数量热致死菌的LAMP与PCR扩增均被抑制。

图5 EMA-LAMP和EMA-PCR扩增混合菌中活菌细胞的DNAFig.5 EMA-LAMP and EMA-PCR amplitication of the viable cells from a mixture of viable and dead cells

3 讨论

用EMA检测细菌的VBNC虽然有诸多优点，但研究发现一定浓度的EMA也会对活细胞产生毒副作用［13］，可抑制活细胞DNA扩增，因此使其应用也受到较大的限制。EMA毒副作用与菌液温度和EMA曝光时间有关。因为温度对细菌细胞膜的渗透性和流动性有一定的影响［14］。因此，曝光时要放在冰上，防止升温，且需要对EMA最佳曝光时间进行摸索。在扩增混合菌时，进行多次离心去掉EMA，防止除了进入死菌细胞外的多余EMA对活菌细胞产生毒副作用。

叠氮溴化丙锭(propidium monoazide，PMA)作为一种高亲和力光解DNA染料，结构和作用类似于EMA。PMA能够与细菌死细胞的DNA共价结合并抑制其PCR反应，使得PCR只能够检测到细胞膜完整的细菌活细胞，而无法检测到细胞外DNA和细胞膜破损的细菌死细胞。将EMA和PMA穿透活细胞细胞膜的能力进行比较，发现虽然EMA能穿透厌氧菌的细胞膜，但是会造成DNA损失，与此相比，PMA的优势在于无法穿透厌氧菌的细胞膜。研究发现EMA不仅抑制死细胞扩增，也能降低活细胞扩增效率，而PMA只能选择性抑制死细胞PCR扩增。虽然，PMA-PCR检测细菌活的非可培养状态逐渐变成当前研究的热点，但是有实验表明PMA抑制死菌扩增的用量要大于EMA，而且价钱比EMA高。所以，目前主要还是应用EMA与PCR等技术结合进行死/活细胞的鉴定。但无论是应用EMA还是PMA，该方法都是结合了EMA(PMA)选择渗透性和PCR特异性，作为一种区分细胞死活的方法，可以在一定程度上有效检测细菌VBNC细胞。

本试验针对副溶血性弧菌种特异性基因tlh作为检测的靶基因，采用了一种将DNA染料EMA(ethidium bromide monoazide)与LAMP结合的分析方法，对浓度为1.0×108cfu/mL的副溶血性弧菌的活细胞、热杀死细胞和死活混合细胞进行了检测，并与EMA-PCR相比较，结果如下:①采用煮沸法和TZ法提取DNA作为LAMP扩增的模板，发现2种方法扩增的条带亮度基本无差距，说明采用不同的提取DNA的方法进行LAMP扩增无影响;②EMA浓度对副溶血性弧菌活菌LAMP扩增几乎无影响，而抑制PCR扩增的最大EMA浓度为40 μg/mL;③抑制副溶血性弧菌死细胞LAMP扩增的最小EMA浓度为8.0 μg/mL，抑制死细胞PCR扩增的最小EMA浓度为4.0 μg/mL。表明，EMA-LAMP抑制死细胞所用的EMA浓度大于EMA-PCR，也就是说EMA-LAMP更能保证检测的灵敏度与准确性;④选择8.0 μg/mL的EMA检测1.0×108cfu/mL的副溶血性弧菌的活细胞，确定EMA激活光解进入死细胞中且与DNA结合的最佳曝光时间至少为25 min;⑤在用EMA-LAMP和EMA-PCR扩增混合菌中活菌细胞DNA检测中，将相同浓度的热杀死细胞菌悬液(1.0×108cfu/mL)混合于不同浓度的活细胞菌悬液中(1.0×108～1.0×100cfu/mL)的扩增结果与上述活菌细胞悬液混合无菌水的EMALAMP(EMA-PCR)扩增结果基本一致，说明EMALAMP和EMA-PCR能够有效区分混合菌中的活细胞，且EMA-LAMP的检出限为1.0×102cfu/mL，EMA-PCR的检出限为1.0×105cfu/mL，再次证明EMA-LAMP的检测灵敏度优于EMA-PCR;⑥将相同浓度的活菌细胞悬液(1.0×108cfu/mL)混合于不同浓度的热杀死细胞菌悬液(1.0×108～1.0×100cfu/mL)的EMA-LAMP和EMAPCR扩增条带的亮度并无明显区别，表明不同数量热致死菌的LAMP(PCR)扩增均被抑制。

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