慢性乙型肝炎病毒耐药突变体研究

陈俊意，朱照静，张如超，杨治国，蒋洪辉，邓才彬，谭丽，黄晓可

(重庆医药高等专科学校重庆医学生物技术研究所/临床医学系，重庆400030)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)是引起病毒性肝炎的主要病原体［1-5］，由HBV所引起的乙型病毒性肝炎是严重危害我国人民健康的传染病。我国慢性乙肝病毒感染者占全世界的1/4，拉米夫定(lamivudine)和阿德福韦双酯(adefovir dipivoxil)是目前广泛用于治疗慢性乙型肝炎的核苷类似物药物，这2种药物可以在单一治疗或在联合治疗中使用。但由于耐药HBV病毒株的出现，治疗效果常常不能持久。有些患者在治疗中或治疗后观察到肝炎突然发作，可再次检测到HBV DNA，使得乙型病毒性肝炎治疗成功率一直不高［6-10］。临床研究表明，用于临床治疗的核苷(酸)类似物产生的耐药是由于HBV发生了突变，进而导致药物抑制病毒复制的作用明显减弱。因此在新的抗病毒药物投入临床使用之前，对HBV耐药突变体进行筛选，对耐药的分子机制进行研究，变得更加迫切。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病例重庆肿瘤医院40岁男性患者1名，HBsAg阳性、HBeAg阳性，该患者以前未接受抗病毒治疗，入院后用抗病毒核酸类药物治疗。最开始用拉米夫定治疗16周，而后用拉米夫定和阿德福韦混合治疗16周。

1.1.2 血清收集和相关指标测定分别于0、18、22、60和70周收集患者血清。测定丙氨酸氨基转移酶(glutamate-pyruvate transaminase，ALT)及HBV DNA滴度，均利用商业试剂盒按照临床要求测定。直接测序确定HBV基因型。

1.2 方法

血清中HBV DNA提取按照试剂盒说明书(Omega，America)进行，反应体系总体积30 μL，20 mmol/L Mg2+3 μL、2 mmol/L dNTP 3 μL、10×buffer 3 μL、引物3 μL、模板3 μL、Tag酶0.2 U，用去离子水(DH2O)补足体积。用一对外引物(P1、P2)进行第1轮PCR，P1为5'-AAGGGTATCTTGCCCGTTTGTCGTA-3'，P2为5'-AAGCAGGATAGCCACAGA-3'，扩增条件:94℃预变性5 min，94℃变性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸60 s，36个循环后，72℃再延伸10 min，第1轮产物为模板，以引物P3(5'-AAGGCACTTGTATTCCCATCCGAG-3')和P4(5'-AAGGTCTATTTACAGGGGA-3')进行第2轮PCR。扩增条件:94℃预变性5 min，94℃变性30 s、56℃退火30 s、72℃延伸30 s，36个循环后，72℃再延伸5 min。最后将PCR产物分别在3%琼脂糖中进行电泳，同时加入Marker通过产物片段的大小来判断基因型。

2 结果与分析

2.1 患者血清HBV的DNA滴度测定

慢性乙肝病毒感染者血清HBV的DNA滴度是反映HBV病毒多少的一项重要指标。由图1可知，患者入院后，血清HBV的DNA滴度在18周为最高，以后逐步下降，在60周时最低，后又稍微升高。

图1 患者血清HBV的DNA滴度Fig.1 HBV DNA counts

图2 患者丙氨酸转移酶活性Fig.2 Alamine aminotransferase(ALT)concentrations

2.2 患者血清丙氨酸转移酶活性

患者血清丙氨酸转移酶活性是衡量慢性乙肝病毒感染者利用核苷酸类似物治疗结果的重要生物化学指标，由图2可知，患者血清丙氨酸转移酶活性在18周为最高，以后逐步下降，22周后保持在较低水平。

2.3 患者血清HBV突变体

在该名慢性乙肝病毒感染者利用核苷酸类似物治疗的过程中，筛选到了其血清中HBV突变体。由表1可知，在病人入院未治疗即0周的时候，发现2个突变体M204V和T213T;在拉米夫定治疗期间，在18周和22周分别检测到突变体LMV rtH69T(YMDDlocus)和LMV rtT184T(YMDDlocus)、LMV rtM204I(YMDDlocus)。在60周和70周分别检测到ADV T213S、ADV T222A、ADV K212T和ADV S196L、ADV S242H，其中ADV S196L和ADV S242H 2种突变体是首次检测到。

表1 不同治疗阶段血清样品中突变体分析(数值为相应克隆比值，%)Table 1 Evolution ofdrug resistant mutatios on clonal analysis of serial samples.Values are relative of clones(%)

3 讨论

在利用核苷类似物药物拉米夫定和阿德福韦双酯治疗慢性乙型肝炎的过程中，随着治疗手段的进步，HBV病毒迫于环境选择压力，也在不断地突变和进化，从而抑制了慢性乙型肝炎患者的治愈率，缩短了患者存活时间，临床上至今无法解决这一难题。同时增加了慢性乙型肝炎患者的治疗成本，延长了治愈时间。

从本实验可以看出，患者在0周没有开始治疗之前就已经有了2个突变体M204V和T213T，说明患者作为被感染者，HBV病毒抗核苷类似物突变体就已经在其他患者身上存在，可能是作为传染源患者在接受核苷类似物治疗的时候，HBV病毒就已经发生突变。在18、22和60周筛选出的患者HBV病毒突变体，其他研究者以前均发现过。而在70周筛选出的患者HBV病毒突变体ADV S196L和S242H，以前没被发现过，说明在生存环境变化的条件下，HBV病毒的突变是不定向的，这给治疗慢性乙型肝炎新药物研制带来了极大的困难。

检测HBV耐药突变的方法，有基因芯片技术和PCR产物直接测序等。拉米夫定和阿德福韦双酯是目前被批准并广泛应用于治疗慢性乙型肝炎的核苷类似物药物，拉米夫定和阿德福韦致使HBV产生相关的耐药位点。临床研究表明，由于HBV聚合酶氨基酸序列发生了突变，使得药物与HBV聚合酶的亲和力下降，这是产生核苷(酸)类似物耐药的根本原因，进而导致药物抑制病毒复制的作用明显减弱。尽管有许多内外因素，如临床用药方式不当、患者年龄、感染时间长短、性别差异等影响慢性乙型肝炎的治疗效果，但HBV产生耐药突变体仍然是慢性乙型肝炎患者治疗失败的最重要因素。现有抗病毒药物还很少，因此慢性乙型肝炎的临床治疗还需要新药的投入。

［1］ Miyakawa Y.，Mizokami M..Classifying hepatitis B virus genotypes［J］.Intervirology，2003，46(6):329-338.

［2］ Chun-Jen Liu，Jia-Horng Kao，Ding-Shinn Chen.Therapeutic implications of hepatitis B virus genotypes［J］.Liver International，2005，25(6):1097-1107.

［3］ Mamun-Al Mahtab，Salimur Rahman，Mobin Khan，et al.Hepatitis B virus genotypes:an overview［J］.Hepatobiliary Pancreat Dis Lnt.，2008，7(5):457-464.

［4］ Anna Kramvis，Kazuko Arakawa，Mimi C.Yu，et al.Relationship of Serological Subtype，Basic Core Promoter and Precore Mutations to Genotypes/Subgenotypes of Hepatitis B Virus［J］.Journal of Medical Virology，2008，80(1):27-46.

［5］ Jie Yang，Ke Xing，Riqiang Deng，et al.Identification of hepatitis B virus putative intergenotype recombinants by using fragment typing［J］.Journal of General Virology，2006，87(8):2203-2215.

［6］ Peter Simmonds，Sofie Midgley.Recombination in the gwnesis and evolution of hepatitis Bvirus genotyprs［J］.Journal of Virology，2005，79(24):15467-15476.

［7］ Zhanhui Wang，Yasuhito Tanaka，Yuehua Huang，et al.Clinical and virological characteristics of hepatitis B virus subgenotypes Ba，C1，and C2 in China［J］.Journal of Clinical Microbiology，2007，45(5):1491-1496.

［8］ Marie Matsuda，Fumitaka Suzuki，Yoshiyuki Suzuki，et al.Low rate of YMDD motif mutations in polymerase gene of hepatitis B virus in chronically in fected patients not treated with lamivudine［J］.J Gastroenterol，2004，39(1):34-40.

［9］ Paul L.Bollyky，Andrew Rambaut，Paul H.Harvey，et al.Recombination between sequences of hepatitis B virus from different genotypes［J］.J Mol Evol，1996，42(2):97-102.

［10］ FeiFei Wang，Honghai Wang，Hongbo Shen，et al.Evolution of Hepatitis B Polymerase Mutations in a Patient with HbeAg-Positive Chronic Hepatitis B Virus Treated with Sequential Monotherapy and Add-on Nucleoside/Nucleotide Analogues［J］.Clinical Therapeutics，2009，31(2):360-366.