8-羟基脱氧鸟苷在玻碳电极上的电化学行为研究

韦寿莲，梁 慧,陈宏彬

（肇庆学院 化学化工学院,广东 肇庆 526061）

8－OHdG是由活性氧自由基攻击DNA分子中的鸟嘌呤碱基第8位碳原子而产生的一种氧化性化合物[1－2].由于DNA的氧化损伤与基因突变、细胞癌变及个体衰老等密切相关，因此研究DNA中8－OHdG的水平对评估机体氧化损伤的程度、衰老机制、癌发生机制均有重要意义.

目前,8－OHdG的分析方法主要有32P后标记法[3]、高效液相色谱－电化学法[4]、气相色谱－质谱法[5]、酶联免疫吸附(ELISA)法[6]、毛细管电泳检测法[7]、电化学法[8－10]等.这些方法各有优势与不足：如32P后标记法操作复杂，易造成放射性污染；而毛细管电泳检测法的灵敏度较低；电化学分析法则具有简单、快速、灵敏等特点.Brett等[8]直接采用玻碳电极检测8－OHdG，检出限达0.8 μmol/L.为提高检测灵敏度，文献[9－10]的作者分别以碳纳米管分散到聚乙烯或直接以碳纳米管修饰电极，获得的检出限分别达0.1 μmol/L和9 nmol/L，但修饰电极制备相对比较复杂.本文中，笔者采用电化学分析法对8－OHdG在玻碳电极上的电化学行为进行研究.

1 实验部分

1.1 实验仪器与试剂

实验采用CHI 612A电化学工作站(上海辰华仪器公司)；三电极系统：玻碳电极为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝为辅助电极；PXS－450型精密酸度计.实验试剂如下：8－OHdG购自sigma公司(St.Louis.Mo.USA)；其他试剂均为国产分析纯试剂；实验用水为二次蒸馏水.

1.2 实验方法

1.2.1 溶液的配制

配制B－R缓冲液：准确称取硼酸4.946 4 g，于烧杯中分别加入冰醋酸4.6 mL和磷酸5.33 mL，用双蒸水稀释至1 000 mL，配成浓度为0.04 mol/L的三酸混合液.

Na2HPO4－NaH2PO4缓冲液(pH值为5.0)的制备：取一定量的磷酸二氢钠溶液0.05 mol/L，用氢氧化钠试液调节pH值至5.0，即得.

1.2.2 电极预处理

玻碳电极表面用纳米级Al2O3粉末抛光至镜面,用超纯水洗涤干净,晾干备用.

1.2.3 循环伏安法

取一定量的8－OHdG置于10 mL容量瓶中,加入支持电解质的溶液至刻度，摇匀，移入电解池.采用三电极系统,在0～＋1.5 V范围内进行循环伏安扫描,考察其电化学特性.

1.2.4 恒电位库仑电解法

在含7.06 μmol/L 8－OHdG的25 mL 50 mmol/L Na2HPO4－NaH2PO4缓冲液(pH值为5.0)中通N2除氧l h，在玻碳电极上于0.63 V处电解2 h，记录法拉第电流I和持续时间；同时，在相同的条件下对底液进行电解，记录在该电位氧化所产生的连续法拉第电流，作为空白值予以扣除.

2 结果与讨论

2.1 支持电解质的选择

分别考察8－OHdG在50mmol/L（pH值为5.0）的HAc－NaAc、HCI－NH4CI、柠檬酸－柠檬酸钠、Na2HPO4－NaH2PO4及B－R等缓冲液中的循环伏安行为.结果发现8－OHdG在Na2HPO4－NaH2PO4缓冲液中的峰电流最大，峰形最佳，因此选择Na2HPO4－NaH2PO4缓冲液为支持电解质.

图1 8－OHdG的循环伏安图（扫描速率100 mV/s）

2.2 8－OHdG的伏安特性

在含7.06 μmol/L 8－OHdG的50 mmol/L Na2HPO4－NaH2PO4缓冲液(pH值为5.0)中，在0～＋l.3 V范围内对8－OHdG进行5次循环伏安扫描，结果见图1.由图1可知第1周扫描在约＋0.62 V处出现一个明显的氧化峰，无还原峰.连续环扫2～5周后，氧化峰电流不断降低，表明氧化过程生成的产物在电极表面有一定的吸附性.8－OHdG氧化峰电位随扫描速率增大而逐渐正移，显示出不可逆波的特征，说明8－OHdG在电极上的电化学氧化过程是不可逆的.

2.3 支持电解质pH值对峰电流、峰电位的影响

考察50 mmol/L Na2HPO4－NaH2PO4缓冲液（pH值在2.0～7.0范围内）对7.06 μmol/L 8－OHdG峰电流、峰电位的影响.结果发现，8－OHdG的氧化峰电流在pH值为5.0时达到最大且相对较稳定，故选择pH值为5.0的缓冲液.而8－羟基脱氧鸟苷的峰电位随pH值的增加而负移（见图2），并且二者呈现良好的线性关系（r＝0.995 3），其斜率为－0.054 5，可以推断氢离子参与了电极反应[11].

图2 pH值对峰电位的影响（扫描速率100 mV/s）

2.4 8－OHdG体系的稳定性

在最佳实验条件下，每隔一段时间对同一份8－OHdG溶液进行CV测定.结果表明8－OHdG体系在室温下至少可以稳定7 h左右.

2.5 不可逆吸附体系有关参数的测定

2.5.1 恒电位库仑法测定电极反应电子转移数n

按1.2.4中的步骤电解溶液，根据公式n＝ΔQ/(FCV)求出电极反应电子数n.式中ΔQ是扣除了底液在相同条件下电解所消耗的电荷量后，电解8－OHdG所需要的净电荷量，F为Faraday常数(96 487 C/mol)，C为电解液中8－OHdG的浓度，V为阳极池中电解液的体积，结果见表1.平行进行3次实验，测得n＝5.8≈6.

表1 恒电位库仑电解8－OHdG的结果

2.5.2 动力学参数an

由线性扫描实验可得，当8－OHdG浓度为7.06 μmol/L时，峰电流与扫描速率的平方根形成良好的线性关系，Ip＝－0.195 9＋0.112 57 ν1/2(r＝0.993 03)，表明8－OHdG的氧化过程受扩散控制.而峰电位则与扫描速率的对数形成良好的线性关系，线性方程为Ep＝0.005 9 ln v＋0.531 9(r＝0.997 4)，根据Ep＝E＋(RT/anF) ln v[12]，求得an＝4.35(25℃).

2.5.3 电极反应质子转移数

由图2可知，峰电位Ep随pH值增加而负移，表明有质子参与电极反应，且8－OHdG的峰电位Ep与pH值成良好的线性关系，线性方程为Ep＝0.794 4－0.05 45 pH，r＝0.995 3.由Nernst方程式知，Ep与pH值有如下关系式：Ep＝K－(0.059m/an)pH，式中m为质子转移数，因an＝4.35，因此质子转移数m＝4.

2.6 电极反应机理的推测

由电极反应电子转移数和质子转移数，推测8－OHdG在玻碳电极表面的电极反应机理为

3 小结

本文采用循环伏安法和恒电位库仑电解法研究8－OHdG的电化学氧化特性，并计算出了不可逆吸附体系的有关参数，结果表明8－OHdG在玻碳电极表面进行的是6电子4质子的不可逆氧化反应.

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