乌头多糖的提取分离与含量测定

叶思勇 邵孟霞 陈智

[摘要] 目的：从中药乌头（Aconitum Paniculigerum Nakai）中提取多糖并对其进行含量测定。方法：乙醇超声提取得到多糖，采用蒽酮-硫酸比色法、紫外可见分光光度法对其进行含量测定，检测波长为（490±1） nm。结果：乌头多糖在0.020 2～0.101 0 mg/ml范围内有良好的线性关系，r=0.999 7，平均回收率为100.60%，RSD=1.97%。药材中多糖以葡萄糖为标准含量，含量为15.82%。结论：该方法准确快速、重现性好。

[关键词] 乌头；多糖；提取；蒽酮-硫酸法

[中图分类号] R283.1 [文献标识码] A[文章编号]1673-7210（2011）11（c）-070-02

Studies on extraction and determination of polysaccharide in Aconitum Paniculigerum Nakai

YE Siyong, SHAO Mengxia, CHEN Zhi

Department of Pharmacy, the Second People's Hospital of Ji'nan City, Shandong Province, Ji'nan 250001, China

[Abstract] Objective: To extract and determine the content of polysaccharide in Aconitum Paniculigerum Nakai. Methods: Polysaccharide was abtained by ethanol, and the content of polysaccharide was identified by anthrone-sulfuricacid colorimetry and UV method with the wavelength was (490±1) nm. Results: Polysaccharide had a good linearity within 0.020 2-0.101 0 mg/ml (r=0.999 7), the average recovery was 100.60% and RSD was1.97%. Conclusion: This method is quick, accurate and reliable for determination of Aconitum Paniculigerum Nakai.

[Key words] Aconitum Paniculigerum Nakai; Polysaccharide; Extraction; Anthrone-sulfuricacid determination

圆锥乌头（Aconitum Paniculigerum Nakai）是乌头的一种，属毛茛科乌头属，其块根呈不规则倒圆锥形，圆锥乌头资源较丰富，该块根在吉林、辽宁等地做草乌用[1]，植物多糖广泛的生物活性已逐渐被人们利用，其独特活性和来源的天然性在保障人体健康应用中具有很大潜力[2-3]。药理研究表明，从乌头水提物中得到的乌头多糖具有降血糖作用[4]，本实验对乌头多糖提取工艺进行初步研究，旨在为乌头多糖的提取和开发利用提供参考依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

UV－3010型紫外可见分光光度计（日本日立）；FA1104型电子天平（上海天平仪器厂）；仪表恒温水浴锅（黄骅市综合电器厂）；Zk-92A真空干燥箱（上海实验仪器厂）。

1.2 试剂

蒸馏水、95％乙醇、蒽酮、浓硫酸等试剂均为分析纯；无水葡萄糖标准品由中国药品生物制品检定所提供，批号：0833-9501，乌头购于山东建联药店，经山东中医药大学中药鉴定教研室鉴定为毛茛科植物乌头的块根。

2 方法与结果

2.1 多糖的提取分离

称取干燥的圆锥乌头粉末5 g，共9份，加入一定量的95%乙醇超声提取一定时间后，离心，弃上清液，留药渣，自然挥干至无醇味。按照L9（34）正交设计试验表对提取次数、溶剂用量、浸渍温度、提取时间4因素进行考察。由方差分析优选最佳提取工艺，结果最佳提取工艺为：提取次数为3次，溶剂用量为20倍量，浸渍温度为45℃，提取时间为40 min。

2.2 乌头多糖含量测定方法学研究

2.2.1 葡萄糖对照品溶液的制备精密称定干燥至恒重的葡萄糖对照品16.83 mg置于25 ml容量瓶中，以蒸馏水定容至刻度，配成0.673 mg/ml的储备液。精密吸取0.673 mg/ml葡萄糖对照品溶液3 ml定容至25 ml容量瓶中，得葡萄糖对照品溶液0.080 8 mg/ml。

2.2.2 供试品溶液的制备精密称定多糖0.151 0 g于25 ml容量瓶中，以蒸馏水定容至刻度，得6.04 mg/ml的多糖溶液。

2.2.3 蒽酮-硫酸试液的制备精密称量0.2 g蒽酮，将其溶解到5 ml乙醇中，再于100 ml容量瓶中以75%硫酸定容，现配现用。

2.3 最大吸收波长的选择

精密吸取0.080 8 mg/ml的葡萄糖对照品溶液2 ml和6.04 mg/ml的多糖溶液2 ml于试管中，冷水浴5 min，加入蒽酮-硫酸试液8 ml摇匀，立即置沸水浴加热10 min，立即置冷水中冷却至室温40 min，以2 ml蒸馏水代替葡萄糖溶液如上法配制空白，用紫外可见分光光度计在500～750 nm内进行波长扫描。结果表明，在波长为（490±1） nm处溶液有最大吸收，故选择（490±1） nm作为检测波长。

2.4 标准曲线的制备

用0.080 8 mg/ml的葡萄糖对照品溶液中分别配制0.020 2、0.040 4、0.060 6、0.080 8、0.101 0 mg/ml 5个不同浓度的对照品系列溶液。分别精密吸取2 ml置具塞试管中，冷水浴5 min，加入蒽酮-硫酸试液8 ml摇匀，立即置沸水浴加热10 min，取出用冷水冷却至室温，室温放置40 min，以2 ml蒸馏水代替葡萄糖溶液如上法配制空白，于625 nm处测定吸光度。以吸光度（Y）对葡萄糖浓度(mg/ml)（X）进行线性，得回归方程为Y=6.445 5X+0.016 6 （r=0.999 8），表明在0.020 2～0.101 0 mg/ml范围内葡萄糖含量与吸光度呈良好的线性关系。见图1。

2.5 精密度试验

精密吸取2 ml供试品溶液，共6份，按“标准曲线的制备”项下操作，分别测定吸收度。结果显示，RSD=0.22%（n=6），表明仪器的精密度良好。

2.6 稳定性试验

精密吸取2 ml样品溶液，按“标准曲线的制备”项下操作，置阴暗处室温条件下放置，分别于0、30、60、90、120、150 min测定吸光度，以此考察其稳定性。结果显示，RSD=0.17%（n=6），表明样品溶液在150 min内显色稳定，可进行测定。

2.7 重现性试验

精密称取同批样品粉末1 g，共6份，按“多糖的提取分离”项下操作制备多糖，按“供试品溶液的制备”项下操作制备供试品溶液，按“标准曲线的制备”项下操作，分别测定吸光度。结果显示，RSD=0.23%（n=6），表明此测定方法重现性良好。

2.8 加样回收率试验

精密称定多糖样品50 mg，共6份，分别加入葡萄糖对照品0.7 mg，按“供试品溶液的制备”和“标准曲线的制备”项下操作，测定各试验液中多糖的量，并计算回收率。结果显示，样品回收率RSD=1.97%（n=6），表明该方法准确度高。见表1。

2.9 含量测定

精密吸取“2.2.2”项下供试品溶液2.5 ml于25 ml容量瓶中，定容至刻度，分别吸取2 ml至具塞试管中，按“标准曲线的制备”项下操作，测定吸光度，平行测定3次，计算平均值，按标准曲线方程计算药材中多糖含量。实验结果表明，药材中的多糖以葡萄糖为标准含量，含量为15.82%。见表2。

3 讨论

3.1 多糖的含量测定

植物多糖组成复杂，获得相应多糖对照品也比较困难，在多糖含量测定时，往往采用单糖如葡萄糖代替对照品，以测定样品多糖的相对含量。本法的原理为糖类在强酸作用下脱水生成糖醛及其衍生物，与蒽酮缩合生成有色物质，其生成量可用于其定量研究。

3.2 多糖测定的准确度

蒽酮-硫酸比色法测定乌头多糖时，采用冰水浴中加入硫酸-蒽酮溶液，可提高乌头多糖测定的准确度。

3.3 蒽酮-硫酸法测定乌头多糖含量的优点

在最佳操作条件下，利用蒽酮-硫酸法测定乌头多糖含量的精密度试验RSD为0.22%，平均回收率为100.60%，RSD为1.97%，测得样品中乌头多糖含量为15.82%，提示本法简单、显色稳定、灵敏度高、重现性好。

[参考文献]

[1]肖培根.中药志[M].北京:人民卫生出版社,1979:128.

[2]王庭欣,王庭祥,庞佳宏.植物多糖生物活性研究进展[J].食品研究与开发,2005,26(2):200-202.

[3]张宪党,马驰,张群,等.植物多糖抗辐射损伤作用研究进展[J].中国辐射卫生,2003,12(2):122-123.

[4]Konno C, Murayama M, Sugiyama K, et al. Isolation and Hypoglycemic Activity of Aconitans A, B, C and D, glycans of Aconitum camichaeli Roots1 [J]. Planta Med,1985,4(2):160.

（收稿日期：2011-06-03）

[作者简介] 叶思勇（1970.6-），男，本科，主管药师；研究方向：制剂学。