缺血对胰岛素抵抗大鼠Apelin mRNA、APJ mRNA表达的影响

马芳义 魏芳晶

[摘要] 目的：研究胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）大鼠心肌Apelin、孤儿G蛋白偶联受体（APJ）表达及缺血对它的影响。方法：将24只SD大鼠随机分三组，即IR组、IR+缺血组和对照组，每组8只。采用Real-time-PCR法测定心肌组织Apelin mRNA和APJ mRNA表达水平。结果：IR组Apelin mRNA、APJ mRNA相对表达量较对照组升高，两组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。IR+缺血组Apelin mRNA、APJ mRNA相对表达量较对照组降低，两组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：大鼠心肌组织存在Apelin、APJ表达。在胰岛素抵抗大鼠中，心肌组织Apelin、APJ代偿性表达增加，推测Apelin、APJ可能参与了胰岛素抵抗的发生，对心脏发挥保护性作用。胰岛素抵抗大鼠心肌缺血后，心肌组织Apelin、APJ表达明显下降，推测可能与Apelin代偿不足或由于肾素-血管紧张素-醛固酮系统激活，反馈性抑制Apelin、APJ表达有关，Apelin、APJ对心脏的保护作用减弱。

[关键词] 缺血；胰岛素抵抗；Apelin；APJ

[中图分类号] R587.1 [文献标识码]A [文章编号]1673-7210（2011）11（c）-027-02

Effects of ischemia on the expression of Apelin mRNA and APJ mRNA in insulin-resistant rats

MA Fangyi1, WEI Fangjing2

1.Department of Cardiology, the Hospital of Bayannaoer City in Inner Mongolia Autonomous Region, Bayannaoer 015000, China; 2.The Health Center of the Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical College, Hubbot 010050, China

[Abstract] Objective: To study the expression of Apelin and APJ in the myocardial tissue of insulin-resistant rats and the effects of ischemia on it. Methods: 24 SD rats were randomly divided into three groups, IR group, IR+ischemia group and control group. The expression of APJ mRNA and Apelin mRNA were tested with Real-time PCR method. Results: Compared with the control group, Apelin mRNA relative expression, APJ mRNA relative expression in insulin resistance group increased, there was a significant difference (P<0.05). Compared with the control group, Apelin mRNA relative expression, APJ mRNA relative expression in IR+ischemic group significantly decreased, there was a significant difference (P<0.05). Conclusion: There are the expression of Apelin and APJ in the myocardial tissue of rats. The expression of Apelin and APJ was increased in insulin resistance rats. Apelin and APJ may be involved in the occurrence of insulin resistance to protect the heart. Myocardial Apelin and APJ expression significantly decrease in insulin-resistant rats after myocardial ischemia, suggest that Apelin may be inadequate or the renin-angiotensin-aldosterone system is activated to inhibit the expression of Apelin and APJ, which weaken the protective effect of Apelin and APJ on the heart.

[Key words] Ischemia; Insulin resistant; Apelin; APJ

近年来多项研究已经证明胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）不仅是动脉粥样硬化、冠心病发生的独立危险因素，而且是血脂代谢异常、高尿酸血症以及肥胖等疾病发生的独立危险因素。研究发现脂肪因子在IR的发病中发挥很重要的作用，是联系肥胖和糖尿病及其并发症的中间环节。新的脂肪因子Apelin是Tatemoto等[1]研究者于1998年采用反向药理学的研究方法从牛胃的分泌物中提取出来，并纯化出的孤儿G蛋白偶联受体（APJ）的天然配体。APJ（apelin-angiotensin recepor-like）受体之所以被称为孤儿G蛋白偶联受体是由于研究者1993年发现APJ时找不到其内源性配体人原因。Apelin通过与其受体APJ结合，对心血管系统发挥着极其重要的调节作用。本研究从基因及蛋白水平寻求缺血、IR与心肌组织Apelin、APJ表达的关系，旨在探讨IR大鼠心肌Apelin、APJ表达及缺血对它的影响，为临床IR的缺血性心血管疾病治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

大鼠胰岛素ELISA试剂盒：R&D;分装。盐酸异丙基肾上腺素购自Sigma公司。Trizol试剂盒购自Invitrogen公司。PCR引物购自生工生物工程（上海）有限公司。M-MLV反转录试剂盒购自Takara公司。Real-time PCR扩增试剂盒购自北京泽平生物技术有限公司。100 bp DNA Ladder购自北京全式金生物技术有限公司。

1.2 实验动物分组及预处理

24只雄性SD大鼠，体重在200 g左右，由北京维通利华实验动物有限公司提供。将大鼠随机分三组：IR组、IR+缺血组和对照组，每组各8只。IR、IR+缺血组喂高脂饲料，对照组喂基础饲料。高脂饲料由北京科奥协力饲料有限公司加工制成。14周后，血糖仪测定空腹血糖（FBG）、ELISA法测定空腹胰岛素（Fins）的量，计算胰岛素抵抗指数（HOMA-IR指数）＝（FBG×Fins）/22.5，喂高脂饲料大鼠的HOMA-IR指数大于喂基础饲料大鼠HOMA-IR指数均数加1.96个标准差，则判定其为IR大鼠[2]，判断IR造模成功后，给IR+缺血组皮下注射异丙基肾上腺素1 mg/（kg·d）体重，连续7 d。其余两组注射相同体积的生理盐水。

1.3 观测指标及实验方法

1.3.1 心肌组织病理学分析取心肌标本制作石蜡切片，HE染色后观察形态学改变。

1.3.2 Real-time PCR法测定心肌组织Apelin mRNA、APJ mRNA相对表达量无菌条件下取心肌组织分切，置于-170℃液氮贮存罐中。操作步骤按试剂盒说明进行，实验步骤：总RNA提取物的获取、RNA的体外反转、Real-Time PCR扩增、实时检测和定量扩增的产物、ΔΔCt相对定量法。

1.4 统计学处理

采用SPSS 13.0软件进行统计分析，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，采用单因素方差分析，两两比较用LSD法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 光镜下心肌标本观察（HE染色）

对照组：心肌排列方向整齐，横纹可见。IR组：心肌细胞萎缩。IR+缺血组：心肌细胞萎缩，间质水肿，部分心肌呈波浪状、横纹消失，部分胞浆呈嗜酸性变。见图1。

2.2 Real-time PCR法定量

IR组Apelin mRNA、APJ mRNA相对表达量高于对照组（P<0.05）；IR组Apelin mRNA、APJ mRNA相对表达量显著高于IR+缺血组（P<0.05）；IR+缺血组Apelin mRNA、APJ mRNA相对表达量均低于对照组（P<0.05）。见表1。

3 讨论

Apelin-APJ系统众多的生物学效应与Apelin、APJ广泛的组织分布有关。Apelin既表现出舒张血管的效应，又表现出增强心肌收缩力、减少抗利尿激素的释放等效应，同时兼有抑制人类免疫缺陷病毒的入侵、促进水的摄入、调整生物节律及垂体激素释放等生物学效应[3-4]。有研究表明 Apelin由血管内皮细胞产生和释放，Apelin通过与其受体APJ结合发挥对心肌和血管内皮细胞的保护作用。在心力衰竭以及心肌重塑中Apelin及其受体APJ均有重要的调节作用。心脏和血浆中Apelin的表达在慢性心力衰竭的患者中随着心力衰竭程度加重而减少[5]。Apelin-APJ信号系统具有一定的拮抗肾素-血管紧张素-醛固酮系统激活的作用。

杨秀红等[6]用高脂饮食建立了胰岛素抵抗大鼠模型，证实了血清胰岛素水平是血清Apelin独立相关因素，机体在胰岛素抵抗状态下，血浆胰岛素水平与血浆中Apelin浓度升高呈正相关，这可能与在胰岛素抵抗状态下机体分泌 Apelin增加有关，Apelin、APJ可能作为一种保护性机制而发挥作用。这与本实验胰岛素抵抗大鼠心肌Apelin、APJ表达增加结果相似，Apelin、APJ可能通过拮抗胰岛素抵抗对心肌和血管内皮细胞起到保护作用。

Ouwens等[7]研究指出，高脂喂养的大鼠心肌中胰岛素信号传递途径中相关信号分子表达异常，从而引起大鼠心肌细胞的胰岛素抵抗、心功能低下。隋东虎等[8-9]研究证实在体外循环缺血再灌注机体胰岛素抵抗的同时，亦存在明显的心肌胰岛素抵抗现象，其程度随体外循环时间延长而增强，并与心功能障碍的发生密切相关。本实验给予异丙基肾上腺素导致胰岛素抵抗大鼠心肌缺血，可能进一步引起了其心肌胰岛素抵抗，导致心功能障碍，由于Apelin代偿不足或者由于Apelin拮抗肾素-血管紧张素-醛固酮系统的作用减弱，导致Apelin、APJ表达明显下降。因此，改善胰岛素抵抗对胰岛素抵抗的缺血性心血管疾病极为重要。

[参考文献]

[1]Tatemoto K, Hosoya M, Habata Y, et al. Isolation and characterization of a novel endogenous peptide ligand for the human APJ receptor [J]. Biochem Biophys Res Commun,1998,251(2):471-476.

[2]陈世伟,张立实,张红敏,等.大豆异黄酮对胰岛素抵抗大鼠胰岛素敏感性及瘦素基因表达的影响[J].北京大学学报:医学版,2006,38(2):197-200.

[3]Ashley EA, Powers J, Chen M, et al. The endogenous peptide apelin potently improves cardiac contractility and reduces cardiac loading in vivo [J]. Cardiovasc Res,2005,65(1):73-82.

[4]Szokodi I, Tavi P, Foldes G, et al. Apelin, the novel endogenous ligand of the orphan receptor APJ, regulates cardiac contractility [J]. Circ Res,2002,91(5):434-440.

[5]Chong KS, Gardner RS, Morton JJ, et al. Plasma concentrations of the novel peptideapelin are decreased in paients with chronic heart failure [J].Eur J Heart Fail,2006,8(4):355-360.

[6]杨秀红,陈树春,宋光耀,等.高脂饮食诱导的胰岛素抵抗大鼠血清Apelin水平及其脂肪组织Apelin mRNA的表达[J].河北医药,2011,33(1):5-7.

[7]Ouwens DM, Boer C, Fodor M, et al. Cardiac dysfunction induced by high-fat diet is associated with altered myocardial insulin signalling in rats [J]. Diabetologia,2005,48(6):1229-1237.

[8]隋东虎,石应康,王儒蓉,等.体外循环缺血-再灌注后心肌胰岛素抵抗现象的初步研究[J].中国胸心血管外科临床杂志,2001,8(1):28-31.

[9]隋东虎,石应康,王儒蓉,等.体外循环缺血-再灌注后心肌胰岛素抵抗与心功能障碍的关系[J].中华实验外科杂志,2002,19(3):208-210.

（收稿日期：2011-08-23）

[作者简介] 马芳义（1975-），女，硕士，主治医师。

[通讯作者] 魏芳晶，心血管博士，硕士生导师。