非小细胞肺癌患者外周血Lunx mRNA的检测及意义

邱素芳 陈岩松 陈 燕 潘建基

近年来，RT-PCR方法被广泛应用于各种肿瘤微转移的检测，在肺癌微转移检测中，常用的上皮特异性标志物由于假阳性的存在而使其应用受到限制，目前仍缺乏公认的分子标志物[1，2]。Iwao等[3]采用mRNA差异显示技术筛选克隆了1个人类肺组织特异性基因lunx，试验表明lunx在所有正常肺组织及非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)组织中特异表达，而在其他人类肿瘤及正常组织中极少表达或不表达,且lunx在正常间叶组织中不表达。因此，lunx可望成为肺癌微转移检测的特异分子标志物。本实验以lunx为靶基因采用实时荧光定量RT-PCR法检测了肺癌患者外周血的lunx mRNA，以检验其作为肺癌微转移分子标志物的可行性。

1 材料与方法

1.1 研究对象

福建省肿瘤医院2007年6月～2008年12月确诊为非小细胞肺癌患者共50例，男性30例，女性20例，年龄45～67岁，治疗前抽取外周血行FQ-RT-PCR检测lunx mRNA；对照组为同期我院胸外科住院的良性肺疾病患者(肺大泡、肺结核球、炎性假瘤)20例，男性12例，女性8例，年龄35～65岁；健康体检者30例，男性15例，女性15例，年龄35～65岁。

1.2 实验材料与仪器

主要实验材料：淋巴细胞分离液购自中科院血液病研究所，Trizol试剂、逆转录试剂盒及实时荧光定量RT-PCR试剂盒由中山大学达安基因诊断中心提供。主要仪器：美国ABI7300扩增仪。

1.3 实验方法

1.3.1 标本采集与处理 各入组病例及对照均按标准操作程序抽取静脉血5 ml，置于EDTA-K2抗凝管中，(为避免上皮细胞污染，所有标本均采集2管，以第2管血为分析样本)，于抽血完成后2 h内用淋巴细胞分离液分离各标本中单个核细胞，于-80℃冰箱中保存，待行进一步的总RNA的提取。

1.3.2 引物、探针设计与合成 采用固相亚磷酰胺合成法合成引物与探针，实验方法采用巢式 FQ-RT-PCR法，目的基因Lunx:外侧引物(F)5'-AGTGATTCCTGGCCTGAACAAC-3';外侧引物(R)5'-CCTCTCCTGCTTATCTCTCACAGC-3'。内侧引物(F)5'-CCTGATGGCCACCGTCTCT-3';内侧引物(R)5'-GGGCGTATTCACTTGGAGCTT-3' 。巢式PCR第2轮扩张片段长度为63 bp。探针：5'-FAM-TGTCACCATCCCTCTCGGCA-TAMRA-3' 。以上引物和探针由中山大学达安基因诊断中心提供设计与合成。

1.3.3 RNA的提取和逆转录 采用Trizol试剂溶解细胞，硫氰双胍、酚、氯仿一步法提取待测样本总RNA。用紫外分光光度计测定总RNA量，A260/A280介于1.7～2.0之间，1%琼脂糖凝胶电泳观察RNA的完整性，EB染色可见28 s、18 s条带。

1.3.4 cDNA的合成 按照试剂盒说明书进行。将提取的RNA样本进行逆转录反应。反应体系如下：5X逆转录Buffer 4 μl,10P下游引物(外)R 0.4 μl,dNTPs 0.5 μl,逆转录酶(MMLV) 1 μl，DEPC水 10.1 μl，RNA模板 4 μl，总体积20 μl。反应条件：37℃ 1 h，然后95℃ 3 min。得到的cDNA产物于-20℃保存。

1.3.5 巢式PCR第1轮扩增 取5 μl逆转录反应获得的cDNA模板，按以下反应体系进行第1轮的PCR扩增。5X定性PCR Buffer 10 μl,10P上游引物(外)(F) 1 μl,10P下游引物(外)(R) 1 μl,dNTPs 1 μl,Taq酶1 μl，DEPC水 31 μl，cDNA模板 5 μl，总体积50 μl。反应条件：93℃ 5 min；然后93℃ 30 s，55℃ 45s，72℃ 45 s，共40循环；最后72℃ 7 min。

1.3.6 巢式PCR第2轮扩增 取5 μl第1轮PCR扩增产物为模板，按以下反应体系进行第2轮的PCR扩增。5X定量PCR Buffer 10 μl,10P上游引物(内)(F) 1 μl,10P下游引物(内)(R) 1 μl,探针probe 1 μl,dNTPs 1 μl,Taq酶1 μl，DEPC水 30 μl，模板 5 μl，总体积50 μl。反应条件：93℃ 2 min；然后93℃ 30 s，55℃ 45 s，72℃ 45 s，共40循环；在每次PCR扩增的延伸阶段由扩增仪自动进行荧光信号的收集及检测。

1.3.7 阳性标准品的制备及扩增 Lunx 基因阳性标准品由中山大学达安基因诊断中心构建及定量赋值，浓度为5.3×1012/ml。将标准品稀释成系列梯度，方法如下：取1 μl加水999 μl充分混匀作1000倍稀释，再取5 μl按10倍依次稀释为108、107、106、105、104。在对样本进行第2轮PCR扩增的同时,取107、106、105、1044个梯度标准品进行PCR扩增,条件与1.3.6一致。

1.4 结果判定

待分析样本是否为阳性通过扩增曲线判定,典型的扩增曲线应为“S”型。扩增仪根据系列浓度的标准品的荧光信号值与循环数绘制标准曲线,并根据标准曲线对样本Lunx mRNA进行定值。

1.5 统计学分析

应用SPSS13.0统计软件进行数据处理。χ2检验及Fisher确切概率法，以P<0.05为具有显著性意义。

2 结果

2.1 Lunx mRNA标准品扩增曲线及标准曲线

扩增曲线呈典型的“S”型，标准曲线的线性相关性良好，见图1、图2。检测灵敏度为1000拷贝数/毫升。

图1 Lunx mRNA标准品扩增曲线

图2 Lunx mRNA标准品标准曲线

2.2 非小细胞肺癌患者组与各对照组Lunx mRNA的检测结果

结果显示，NSCLC组Lunx mRNA中位拷贝数(表1)为31 000 copies/ml,阳性率为56%，2个对照组中位拷贝数及阳性率均为0,NSCLC组与2个对照组的差异均有统计学意义(P<0.01)。

表1 肺癌患者及对照组lunx mRNA检测结果

2.3 NSCLC组外周血Lunx mRNA的表达情况与临床病理特征的关系

NSCLC组外周血Lunx mRNA的检测结果与年龄、性别、病理类型无明显关系(P<0.05)；与临床分期有密切关系，中位拷贝数及阳性率随肿瘤临床分期的增加而升高(表2)。

表2 Lunx mRNA表达与NSCLC各项临床因素相关性分析

3 讨论

肿瘤微转移是指恶性肿瘤发展过程中，播散并存在于血液循环、淋巴道、骨髓及各组织器官中的肿瘤细胞，但尚未形成转移性结节，且无任何临床表现，常规病理学、影像学等方法难以发现和检测到的转移，是判断复发、转移和预后的重要指标[4]。

近30年来，尽管随着外科技术的发展，放疗技术的改进，化疗新药的应用以及基因，生物治疗技术的开展，肺癌的综合治疗达到了1个新的水平。但到目前为止，肺癌患者的预后仍没有明显改善，即便是认为可完全切除的Ⅰ～Ⅲa期患者，5年生存率仍在30%～40% ，肺癌患者的预后与癌细胞的转移密切相关。绝大多数患者最终死于复发和转移[5～7]。统计表明，大约40.0%的肺癌患者就诊时已有远处转移。肺癌转移常通过血液和淋巴循环，癌细胞进入循环系统是转移发生的早期。因此。循环中检测出癌细胞在一定程度上表明肿瘤具有较强的转移倾向，这无疑将有助于临床肿瘤的分期和治疗方案的选择。

目前用于检测NSCLC微转移的分子标志物主要分为组织特异性标志物和肿瘤特异性标志物，前者如人肺组织特异性标志物，后者如癌胚抗原等。人肺组织特异性标志物Lunx是Iwao[3]等通过mRNA差异显示技术分离的1个基因，它编码含257个氨基酸，分子量为26.7 kDa的蛋白质。Iwao等[3]用lunx mRNA RT-PCR法检测了NSCLC患者手术切除淋巴结的微转移，结果表明该方法具有很高的敏感性和特异性。2003年Mitas等[8]用PCR法检测肺癌患者外周血，结果41.7%(10/24)为阳性，认为Lunx是1种特异性好、敏感度高的肿瘤标志物。

以TaqMan荧光标记探针为基础的FQ-PCR技术是在常规PCR技术的基础上运用荧光能量传递(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)技术，加入荧光标记探针，即在其5’端标记6-羧基荧光素(FAM)和在3’端标记6-羧基-四甲基罗丹明(TAMRA)，将核酸扩增、杂交、光谱分析和实时检测技术结合起来，利用荧光信号来检测PCR产物，是目前应用较为广泛的基因定量检测方法[9]。巢式PCR是针对同一靶核酸设计一对外引物和一对内引物，先用外引物进行扩增，再用内引物扩增，提高了PCR检测的敏感性。

本研究采用巢式FQ-RT-PCR技术，通过检测非小细胞肺癌组、肺良性疾病组和健康对照组外周血的Lunx mRNA的表达及分析非小细胞肺癌疾病组Lunx mRNA的表达与各临床特征的关系，研究Lunx mRNA作为NSCLC微转移的分子标志物的可行性。结果显示非小细胞肺癌患者组Lunx mRNA检测阳性率为56%，NSCLC组与2个对照组的差异均有统计学意义，与文献相符[10～14]。同时，lunx mRNA的表达与肺癌的分期明显相关，与年龄、性别、病理分型等无明显相关，与文献相符[13,14]。以上结果提示肺癌患者外周血中lunx mRNA的表达来自于转移的癌细胞，而在肺良性疾病和健康人外周血、淋巴结中均未检测到lunx mRNA的表达，表明lunx mRNA作为肺癌转移检测分子标志物具有很好的特异性和敏感性。以上研究提示lunx mRNA是肺癌微转移检测敏感特异的分子标志物，而微转移的检出表明肿瘤具有很高的转移倾向，对临床分期、判断预后和确定手术及术后治疗起到指导作用。血液、淋巴结中检测到少量癌细胞并非最终一定形成显性转移，癌细胞自身生物学特性、机体免疫状况、局部微环境都是重要的影响因素。通过随访，以进一步明确微转移与复发、转移及预后的关系。

[1]Osaki T,Oyama T,Gu CD,et al.Prognostic impact of micrometastatic tumor cells in the lymph nodes and bone marrow of patients with completely resected stage I non--small- cell lung cancer〔J〕.J Clin Oncol，2002，20(13)：2930.

[2]刘德林，朱广迎，王 绪.肺癌微转移的检测及临床意义〔J〕.中国肺癌杂志，2001，4(2)：121.

[3]Iwao K，Watanabe T，Fujiwara Y，et al.Isolation of a novel human lung specific gene，Lunx，a potential molecular marker for detection of micrometastasis in non small cell lung cancer〔J〕.Int J Cancer，2001，91(2)：433.

[4]Giamieri E，Dc Francersco GP，Carico E，et al.Detection，characterization and clinical significance of circulating cancer cells in patients surgically treated for breast cancer〔J〕.Chic，2004，25(5)：194.

[5]顾 科，张军宁.非小细胞肺癌微转移研究现状〔J〕.实用癌症杂志,2005,20(4)：437.

[6]公雪慧，邬 蒙.非小细胞肺癌微转移检测及其临床意义〔J〕.实用癌症杂志,2005,20(5)：553.

[7]吴一龙.肺癌多学科综合治疗的理论基础〔M〕.北京：人民卫生出版社，2000：1～17.

[8]Mitas M，Hoover L，Silvestrl G，et al.Lunx is a superior molecular marker for detection of non-small cell lung cancer in peripheral blood〔J〕.J Mol Diagn，2003，5(4)：237.

[9]李金明.实时荧光PCR技术〔M〕.北京：人民军医出版社，2007：17.

[10]吴 昊,李 浒,章希贤.非小细胞肺癌患者外周血和骨髓中Lunx基因表达的临床意义〔J〕.中国肿瘤,2006,15(5):329.

[11]宋 萍,李 坚,殷凯生.检测外周血Lunx mRNA表达对于诊断肺癌微转移的临床价值〔J〕.江苏大学学报(医学版)，2006，16(4):304.

[12]朱广迎，刘德林，王 绪.等.lunx mRNA RT-PCR 检测肺癌的微转移〔J〕.中国肿瘤临床，2003，30(2)：124.

[13]刘 静，荣 福.NSCLC外周血、区域淋巴结微转移检测对术前分期的临床价值〔J〕.现代肿瘤医学，2010，3 ：491.

[14]刘宏伟，谢 风，刘 刚.等.RT-PCR法检测非小细胞肺癌患者外周血 Lunx mRNA的表达及临床意义〔J〕.中国实验诊断学,2008,12(8)：905.