产抗菌肽乳源乳酸菌的筛选及定向培养

乔彬，高学军，潘洪宝，于微，尹德云

（东北农业大学乳品科学教育部重点实验室，哈尔滨 150030）

产抗菌肽乳源乳酸菌的筛选及定向培养

乔彬，高学军，潘洪宝，于微，尹德云

（东北农业大学乳品科学教育部重点实验室，哈尔滨 150030）

为了获得乳酸菌高效表达抗菌肽的代谢调控方法，对德氏乳杆菌保加利亚亚种等7种乳酸菌进行了产抗菌肽能力的筛选和定向培养。筛选出具有较高抑菌活性的菌株嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌，它们产生的抑菌物质经排除酸、过氧化氢后，仍具有抑菌活性，然而经蛋白酶处理后其抑菌活性明显下降。结果表明，两种菌发酵上清液对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均有抑制作用。经一系列定向培养嗜酸乳杆菌抑菌直径达到（23.53±0.06）mm，与未经定向培养的抑菌直径（11.63±0.15）mm相比抑菌活性提高了102%；经定向培养的干酪乳杆菌抑菌直径达到（21.27±0.25）mm，与未经定向培养的抑菌直径（12.50±0.10）mm相比抑菌活性提高了70.2%。

乳源乳酸菌；抗菌肽；筛选；定向培养；抑菌活性

0 引言

乳酸菌是目前世界公认安全的食品级微生物，它们产生的抗菌物质是安全的，可作为天然食品防腐剂直接应用于食品工业和畜牧业，因此乳酸菌抗菌能力的挖掘和开发受到了国内外极大关注[1]。齐桂云报道了乳酸杆菌抗菌肽的生物学性质，证实该抗菌肽分子质量为14 ku，可被胰蛋白酶降解[2]。Lemos从食物源339个乳酸菌株中筛选抗微生物活性物质，发现肠球菌能够产生抗多种菌的抗菌肽[3]。Lasta鉴定了乳酸球菌亚种产生的抗菌肽J46，是一个27肽，对G+菌具有很强的抗性[4]。定向培养可通过调节培养基营养成份促进乳酸菌产生更多的抗菌肽，是获得超表达抗菌肽的代谢调控方法。本实验通过筛选产抗菌肽高的乳源乳酸菌，并采用进行定向培养方法以提高产抗菌肽的能力，为乳源乳酸菌抗菌肽的进一步应用提供技术支持。

1 实验

1.1 材料与仪器

1.1.1 菌株

供试菌：德氏乳杆菌保加利亚亚种、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、肠膜明串珠球菌、瑞士乳杆菌、干酪乳杆菌、乳酸乳球菌乳酸亚种（本实验室保存菌种）；指示菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌（本实验室保存菌种）。

1.1.2 培养基

MRS培养基（pH值为6.2～6.4）：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母膏5.0 g，柠檬酸氢二铵2.0 g，葡萄糖20.0 g，吐温80 1.0 mL，乙酸钠5.0 g，磷酸氢二钾2.0 g，硫酸镁0.58 g，硫酸锰0.25 g，琼脂粉18.0 g（固体培养基,液体培养基不加），蒸馏水1 000 mL用于细菌分离。NB培养基：蛋白胨10 g/L,牛肉膏5 g/L，氯化钠5 g/L（均为质量浓度），pH值为7.2～7.4，121℃灭菌15 min，用于指示菌培养。

1.1.3 生理生化鉴定管

葡萄糖，乳糖，麦芽糖，蔗糖，果糖，V·P反应，纤维二糖，阿拉伯糖，木糖，棉籽糖，山梨醇，甘露醇，松三糖（细菌微量生化反应管）。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌菌种的筛选鉴定

（1）乳酸菌的分离纯化。将冷冻干燥的供试菌接种在MRS液体培养基进行活化。乳杆菌采用MRS液体培养基30℃培养24 h。每次测定之前,各菌株均在各自培养基上活化3次以保证菌株的活力得到恢复。然后挑出单一菌落，革兰氏染色，镜检，若菌种单一则-80℃冻存。

（2）产生抑菌活性代谢产物乳杆菌的初筛。采用牛津杯琼脂扩散法进行抑菌活性的筛选。首先将待测菌株活化,培养液经离心(4℃、12 000 r/min、5 min)得发酵上清液。将指示菌悬浊液涂布于NB固体培养基上,培养基上放置4个牛津杯,杯中加入200 μL乳酸菌发酵上清液,37℃培养24 h,测量抑菌圈直径(mm),确定其抑菌效果。每个样品做三次平行实验，选取有明显抑菌圈的菌株做复筛实验。

（3）酸排除实验。以1%的接种量接种于5 mL的MRS液体培养基中，37℃静置培养24 h，培养液以12 000 r/min离心5 min后，用浓度为1.0 mol/L的NaOH或HCl溶液调整发酵上清液的pH值为5.0，采用牛津杯琼脂扩散法测定发酵液和有机酸的抑菌活性。

（4）过氧化氢排除实验。过氧化氢酶溶解在磷酸缓冲液（pH7.0）中配成母液，加入到pH调至7.0的发酵上清液中，使过氧化氢酶的终质量浓度为5 g/L，在37℃水浴中温育2 h后取出，再将pH值调回对照pH值为5.0，用牛津杯检测经过氧化氢酶处理后发酵液的抑菌圈大小。

（5）蛋白酶对其抑菌的影响。将发酵上清液的pH调至各酶的最适pH值,按质量浓度1.5 g/L的比例分别加入胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K,在各自适宜的温度下处理1 h后,沸水浴处理3 min使酶失活,冷却后调pH值为5,测定抑菌活性的变化情况。

（6）产抗菌肽乳酸菌的抑菌谱。将发酵上清液调至pH值为5.0，分别以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌为指示菌做抑菌实验，观察乳酸菌的抑菌谱。

（7）菌株的鉴定。生理生化特性鉴定：根据分离菌的菌落和菌体形态特征，革兰氏染色以及生理生化反应，参照《柏杰氏细菌鉴定手册》[8]第9版和《乳酸菌分类鉴定及实验方法》进行鉴定。

16SrDNA序列分析：对步骤（2）中筛选出的抑菌直径大的菌种进行16SrDNA序列分析，然后用细菌通用引物进行PCR扩增，回收产物送去测序（本实验引物合成及测序均在上海英俊生物科技有限公司进行）。

（8）生长曲线的测定。将种子液以1%的接种量接种于MRS液体培养基中,30℃恒温静置培养,在48 h内,每隔2 h取样,测定发酵液在600 nm处的吸光值OD600。

1.2.2 培养基营养成分的优化

将筛选得到的抑菌活性高的菌株活化，接入NB培养基进行培养，培养条件为：接种量4%，温度30℃,装液量为200 μL/5 000 μL，金黄色葡萄球菌为指示菌，测定抑菌圈直径。

（1）碳源调节对乳酸菌产抗菌肽的影响。在NB培养基中，分别加入1%的葡萄糖、甘露醇、麦芽糖、蔗糖、乳糖、糊精、壳聚糖作为碳源，并以不加以上碳源的基础培养基为对照，将对照的抑菌直径设为100%，选出最佳碳源后再对其添加量进行优化，添加量分别设为0.5%，1%，1.5%，2%，2.5%，3%，4%，5%。

（2）氮源调节对乳酸菌产抗菌肽的影响。方法如1.2.2（1），固定碳源添加量，以1%的不同氮源牛肉膏、蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母浸粉、玉米浆、豆粕粉、硝酸钾、硫酸铵取代基础培养基中的牛肉膏、蛋白胨。添加量分别设为0.5%，1%，2%，3%，4%，5%。

（3）无机盐调节对乳酸菌产抗菌肽的影响。方法如上，固定碳源、氮源添加量，分别以0.1%的CaCl2，NaCl，MgSO4，KH2PO4，FeCl3的金属离子取代基础培养基中的NaCl，添加量分别设为0.3%，0.4%，0.5%，0.6%，0.7%，0.8%。

（4）表面活性剂调节对乳酸菌产抗菌肽的影响。方法如上，固定碳源、氮源、无机盐添加量，分别向其中加入0.5%Tween-80和Tween-20，添加量分别设为0.1%，0.5%，1.0%，1.5%。

（5）通过正交试验确定最佳发酵培养基。为确定最佳发酵培养基成分，试验采用正交设计，通过单因素试验，确定正交试验的各因素水平，对于嗜酸乳杆菌设蔗糖、牛肉膏、NaCl和Tween-80四个因素；对于干酪乳杆菌设蔗糖、大豆蛋白胨、NaCl和Tween-80四个因素，每个因素设三个水平，进行摇瓶发酵试验，确定最佳发酵培养基成分，试验用L9(3)4正交表安排设计。

（6）代谢前体物的添加对乳酸菌产抗菌肽的影响。在优化培养基中分别以添加量为1%加入代谢前体物尿素、Na2SO4。

（7）初始pH对乳酸菌产抗菌肽的影响。用浓度为0.1 mol/L的HCl及0.1 mol/L的NaOH溶液将优化培养基溶液调至pH值分别为4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，最后定容至相同体积，4%接种量，观察不同初始pH对乳酸菌产抗菌肽的影响。

（8）培养温度对乳酸菌产抗菌肽的影响。使乳酸菌发酵液分别在20，30，40，50，60℃条件下培养，观察其对乳酸菌产抗菌肽的影响。

（9）抗菌肽热稳定性研究。分别取发酵上清液1 mL，分别在40，60，80，100，120℃温度下处理30 min，做抑菌试验，观察结果。

（10）拮抗作用。将活化的乳酸菌接200 μL到5 mL优化培养基中40℃培养24 h后，再将活化的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌分别吸取200 μL加入到乳酸菌培养液中，分别在24，48，72，96，120 h对培养液做抑菌试验，测定抗菌活性并且计算有害菌存活率。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌菌种的筛选鉴定结果

（1）乳酸菌的分离纯化结果。根据菌种菌落形态学特征的描述，菌株经过反复平板划线得到纯化，经过格兰氏染色、电镜观察、生理生化实验鉴定，7种乳酸菌均得到单一菌落。

（2）产生抑菌活性代谢产物乳杆菌的初筛结果。对7种乳酸菌进行抑菌活性测定，选取2种高产抑菌物质的产生菌，分别为干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌。

（3）中和法排除有机酸。乳酸和乙酸对指示菌无抑制作用，排除酸作用后，嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌发酵上清液均有较好抑菌作用，结果如表1所示。

表1 两菌种发酵上清液及调节pH后发酵上清液的抑菌圈大小

（4）过氧化氢酶检测排除过氧化氢。两种菌株发酵上清液经过氧化氢酶处理后，抑菌圈直径和发酵上清原液相比变化不大，说明过氧化氢也不是主要的抑菌物质,发酵上清液中还有其他的抑菌活性物质存在。

表2 过氧化氢酶处理前后发酵上清液的抑菌圈大小

（5）蛋白酶检测抑菌物质的蛋白质性质。两种菌株pH值为5时的发酵上清液有较大抑菌圈，被胰蛋白酶作用后抑菌圈消失，此抑菌物质能被胰蛋白酶、胃蛋白酶分解，同时经过高压蒸汽灭菌后，抑菌活性也会完全丧失，产生白色沉淀。说明抑菌物质具有蛋白质性质。此抑菌物质对胰蛋白酶敏感，同时对木瓜蛋白酶、蛋白酶K不敏感。

（6）产抗菌肽乳酸菌的抑菌谱。两种菌株产生的抗菌肽对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有很好的抑制效果。

（7）菌种的鉴定。24 h培养物经革兰氏染色，根据形态特征观察，常规生理生化鉴定及16S rDNA序列的分析，将此2种菌株鉴定为嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌。

（8）生长曲线测定。两种乳酸菌菌数在开始时缓慢上升，经12 h培养后数量级迅速上升，进入对数生长期。嗜酸乳杆菌在27 h后进入生长平台期，直到发酵结束培养液OD值基本上没有变化。干酪乳杆菌在24 h进入生长平台期。

2.2 培养基营养成分优化结果

（1）营养成份调节对乳酸菌产抗菌肽的影响。实验结果表明嗜酸乳杆菌最佳培养条件：蔗糖3.0%，牛肉膏4.0%，NaCl 0.6%，Tween-80 1.5%，抑菌直径（20.47±0.12）mm。干酪乳杆菌最佳培养条件：蔗糖1.0%，大豆蛋白胨3.0%，NaCl 0.7%，Tween-80 1.0%,抑菌直径（19.17±0.15）mm。

（2）正交试验优化结果。通过用L9(3)4正交安排设计单因素试验，确定正交试验的各因素水平。选出最佳配比。嗜酸乳杆菌测定结果：蔗糖3%，牛肉膏4%，NaCl 0.6%，Tween-80 1.0%。干酪乳杆菌测定结果：蔗糖1%，大豆蛋白胨3%，NaCl 0.8%，Tween-80 1.0%

（3）代谢前体物的影响结果。代谢前体物对两种乳酸菌的影响如表3所示。由表3可以看出，尿素在一定程度上可以促进嗜酸乳杆菌产抗菌肽，对于干酪乳杆菌两种代谢前体物对其产抗菌肽都有一定的抑制作用。

表3 代谢前体物对两种乳酸菌产抗菌肽的影响

（4）初始pH值的影响。如表4所示，当pH值为5.0时嗜酸乳杆菌抑菌活性最高。当pH值为6.0时，干酪乳杆菌抑菌活性最高。说明培养基过碱时，不利于菌体生长和抗菌肽的产生。

（5）培养温度的影响结果。温度对两种乳酸菌产抗菌肽的抑菌活性有较大影响，显示40℃时抗菌肽抑菌活性单位最高。

（6）抗菌肽热稳定性研究结果。发酵上清液经40，60，80，100，120℃温度下处理30 min，做抑菌试验，结果显示抑菌直径无规律性变化，说明抑菌活性物质对热有很强的耐受性（如表5）。

（7）拮抗作用影响结果。拮抗作用实验结果如表6所示。由表6可以看出，拮抗作用能明显促进乳酸菌产生更多抗菌肽，同时发现金黄色葡萄球菌对嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌促进效果更明显。两种乳酸菌在拮抗作用72 h时达到最大值，嗜酸乳杆菌达到（23.50±0.10）mm，干酪乳杆菌达到（21.23±0.21）mm。72 h之后抗菌肽含量达到平稳。当嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌分别与大肠杆菌和金黄色葡萄球菌共培养48 h后，金黄色葡萄球菌与大肠杆菌均得到很好的抑制，120 h后，金黄色葡萄球菌和大肠杆菌完全被抑杀。

表4 初始pH值调节对两种乳酸菌产抗菌肽的影响mm

表5 温度对抗菌肽热稳定性的影响mm

表6 拮抗作用对乳酸菌产抗菌肽的影响mm

3 结论

（1）通过对7种乳源乳酸菌进行抑菌试验比较，表明嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌能产生较多抗菌肽。

（2）嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌经过培养基营养成份的调节，抑菌效果明显提高，嗜酸乳杆菌最高达到（20.47±0.12）mm，干酪乳杆菌最高达到（19.17±0.15）mm。嗜酸乳杆菌最优培养基：蔗糖3%，牛肉膏4%，NaCl 0.6%，Tween-80 1.0%。干酪乳杆菌最优培养基：蔗糖1%，大豆蛋白胨3%，NaCl 0.8%，Tween-80 1.0%。

（3）嗜酸乳杆菌与干酪乳杆菌所产抗菌肽经100℃处理30 min仍有较高活性，并对胰蛋白酶和胃蛋白酶敏感。对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌有不同程度的抑制，是一类广谱抗菌肽。

（4）在嗜酸乳杆菌与干酪乳杆菌培养24 h后分别添加金黄色葡萄球菌及大肠杆菌，能有效的促进嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌产生抗菌肽，增强抑菌活性。抑菌活性达到最高值后稳定存在。在共培养120 h后，两种有害菌均被杀灭，可能与培养基有利于乳酸菌生长和产生大量抗菌肽有关，其机理有待进一步研究[9]。

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[4]LASTA S,FAJLOUN Z,DARBON H,et al.Chemical Synthesis and Characterization of J46 Peptide,an Atypical Class IIa Bacteriocin from Lactococcus lactis subsp.Cremoris J46 Strain[J].J Antibiot(Tokyo). 2008,61(2):89-93.

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[7]周德庆.微生物学教程[M].北京:高等教育出版社,2002:372-373.

Selection of milk-source Lactic acid bacteria producing antimicrobial peptides and cultivation for antimicrobial activity

QIAO Bin,GAO Xue-jun,PAN Hong-bao,Yu Wei,Yin De-yun
(Northeast Agricultural University.The Key Laboratory of Dairy Science of Ministry of Education,,Harbin 150030,China)

In order to obtain metabolism control methods for high expression of antimicrobial peptides of lactic acid bacteria.In this experiment,Lactobacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus etc.seven kinds of lactic acid bacteria were isolated and identified and cultured for antimicrobial activities.Excluding the interference of organic acids and hydrogen peroxide,the high antibacterial activities of these lactic acid bacteria were selected.The fermentation supernatant of these two kinds of lactic acid bacteria lost antimicrobial activity in the presence of trypsin.The fermentation supernatant of Lactobacillus acidophilus and Lactobacillus casei had inhibitory spectrum against Staphylococcus aureus and E.coli. After the series of target cultivation,the antibacterial diameter of Lactobacillus acidophilus was(23.53±0.06)mm,while without the target cultivation Lactobacillus acidophilus antibacterial diameter was(11.63±0.15)mm,the antibacterial activity rised by 102%.After target cultivation, antibacterial diameter of Lactobacillus casei was(21.27±0.25)mm,while without target cultivation the antibacterial diameter of Lactobacillus casei was(12.50±0.10)mm,antimicrobial activity rised by 70.2%.

Milk-source lactic acid bacteria;antimicrobial peptides;selection;target cultivation;antibacterial activity

Q93-331，Q93-335

A

1001-2230（2012）01-0025-04

2011-09-08

教育部长江学者和创新团队发展计划项目(IRT0959,NEAU)。

乔彬（1986-）,女,硕士研究生,研究方向为乳酸菌应用生物技术。

高学军