高效木霉菌株对樟子松枯梢病的抑菌机理

邓 勋，宋瑞清，宋小双，尹大川

高效木霉菌株对樟子松枯梢病的抑菌机理

邓 勋1，宋瑞清2，宋小双1，尹大川2

（1.黑龙江省林科院 森林保护研究所，黑龙江 哈尔滨 150040；2.东北林业大学 林学院，黑龙江 哈尔滨 150040）

采用菌株对峙培养法和木霉非挥发性代谢产物对病原菌株的生长抑制法，从28个木霉菌株中筛选对樟子松枯梢病菌抑制效果显著的菌株；比较不同有机溶剂对木霉非挥发性代谢产物中抑菌活性成分的萃取效果，获得对病原菌抑制显著的提取物，研究了高效提取物对樟子松枯梢病菌保护酶活性的影响；分别制备孢子菌剂和液体菌剂对樟子松枯梢病进行了野外防治试验。结果表明：在对峙培养中，引进菌株T-43对樟子松枯梢病菌的抑制效果63.28%，相对抑制效果为6.05，木霉完全覆盖病原菌；木霉非挥发性代谢产物对病原菌株的生长抑制试验中，T-43菌株发酵液及乙酸乙酯提取物对病原菌的抑制率分别为92.94%和90.58%，病原菌菌丝生长稀疏或被完全抑制生长；菌株T-43发酵液的乙酸乙酯提取物对病原菌的主要保护酶SOD、POD、CAT和PPO影响作用显著，提取物通过破坏病原菌的防护系统，抑制病原菌生长；在T-43对樟子松枯梢病的野外防治试验中，引进菌株T-43的防治效果明显好于国内高效菌株T-C14和商品化的木霉分生孢子可湿性粉剂，其中用发酵液制备的液体菌剂10倍液防治效果好于分生孢子菌剂，2011年得病害控制效果达到76.67%。连续的防治可以有效的控制病害的发生。

木霉；樟子松枯梢病；抑菌机理；生物防治

樟子松Pinus sylvestris var. mongolica是我国北方主要造林树种，在生态建设、环境修复方面发挥重要作用[1]。樟子松枯梢病是由松球壳菌Sphaeropsis sapinea（Fr．）Dyko et Sutton引起的一种发病普遍、危害性大的世界性的传染性病害。枯梢病属于寄主主导性病害，对该类病害的控制应以提高寄主抗性及降低病原菌种群数量为主要方向[2]。

木霉菌Trichoderma spp.是自然界中资源丰富的拮抗微生物，具有抗菌谱广、适应性强和多机制性的特点。首先, 木霉菌竞争作用强，木霉菌还能产生挥发性或非挥发性的抗菌类物质，对多种病原菌有抑制作用。此外，它还具有重寄生作用，通过胞外酶破坏病原菌细胞壁，削弱病原菌的生长势, 甚至杀死病原菌[3]，目前世界范围内已有以木霉为主要成分的生物杀菌剂，在农林业生产中发挥重要作用[4]。同时，很多木霉种类对植物还具有促生抗逆的作用，通过定殖和次生代谢产物促进植物生长[5]，提高植物抗病能力。

筛选开发有效控制樟子松枯梢病的木霉菌株及其制剂产品，对保持樟子松林微生态环境的稳定、有效控制枯梢病的发生、减少化学农药的使用具有重要意义。本研究利用筛选获得的高效木霉菌株T-43制备不同剂型菌剂进行了野外应用研究，为进一步研究木霉对松枯梢病菌的抑菌机理并开发稳定的生物菌剂打下理论基础。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

（1）木霉菌株： 28株木霉。国外引进7株，课题组在国内分离21株。上述菌株保存于东北林业大学森林微生物研究中心，菌株具体信息见表2。

（2）病原菌株：樟子松枯梢病菌—松球壳菌Sphaeropsis sapinea（Fr．）Dyko et Sutton，自辽宁省防风固沙研究所章古台实验林场樟子松人工林内感病樟子松上分离，保藏于东北林业大学林学院森林微生物研究中心。

1.2 试验方法

1.2.1 木霉菌株对病原菌株的拮抗效果

采用平板对峙培养法[6]。以单独接种病原菌株和木霉菌株的平板作为对照，每处理3次重复。置于25℃恒温培养箱中培养，每8 h测量一次菌落半径。计算各菌株生长被抑制率、木霉菌株相对抑制效果、木霉菌株生长速度，统计竞争系数。观察是否有拮抗线产生， 对峙培养中竞争系数分级标准见表1[7]。

表1 菌株对峙培养中竞争系数分级标准Table 1 Grading standards for competition coefficients of Trichoderma strains in co-culture

被抑制率（%）=（对照菌落直径-对峙培养菌落直径）/对照菌落直径×100% 。

相对抑制效果=病原菌株被抑制率/拮抗菌株被抑制率。

1.2.2 木霉菌株非挥发性代谢产物对病原菌的抑制效果

非挥发性代谢产物的制备：切取培养好的木霉菌饼3片接种到300 mL PD培养基中，恒温振荡培养（25℃，150 r/min）7 d，过滤菌丝，取滤液分别与正己烷、乙酸乙酯和正丁醇按1:3体积比，静置萃取2 d后分液去除无机相，减压旋转蒸发去除有机相。用滤液1/10体积的5% Tween80溶液溶解萃取物，同时将未萃取的发酵液旋转蒸发浓缩到原体积的1/10，备用。

抑菌活性测定：采用菌丝生长抑制法[8]。将上述非挥发性代谢产物添加到PDA培养基中，摇匀，使非挥发性代谢产物终浓度达到20%。倒平板，接入病原菌，以不添加代谢产物的PDA平板培养作为对照，25℃恒温培养5 d。采用十字交叉法测量病原菌的菌落直径，计算各木霉菌株非挥发性代谢产物对病原菌生长的抑制率，每处理3次重复。

1.2.3 木霉菌非挥发性代谢产物对病原菌保护酶活性的影响

超氧化物歧化酶（SOD）是生物体中最重要的抗氧化酶，能够催化生物氧化过程中产生的超氧阴离子自由基为O2和H2O2，保持细胞膜的结构和功能。过氧化氢酶（CAT）是一种以铁卟啉为辅基的酶，能清除SOD的歧化产物H2O2为O2和H2O，避免某些具有生理功能的蛋白质和巯基酶被氧化，丧失活性，对生物膜造成损伤[9]。过氧化物酶（POD）是清除H2O2与许多有机氢过氧化物的抗氧化酶之一，它对H2O2非常专一。多酚氧化酶（PPO）也是植物重要的保护酶之一[10]。本研究拟从提取物对病原菌保护酶系统中超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）活性的影响角度，探讨木霉菌非挥发性代谢产物的抑菌机理。参考冀瑞卿[11]、计红芳[9]的方法。将PD培养基中培养5 d的病原菌菌丝用无菌水洗净后置于20 mL含10%提取物的无菌水中，静置。分别于2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h、48 h后取样，测定菌丝保护酶活性，以10%吐温80处理为空白对照。SOD、POD、CAT、PPO酶活测定采用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒。

1.2.4 高效木霉菌株对樟子松枯梢病控制的野外应用研究

（1）试验地概况：樟子松枯梢病野外防治基地设在辽宁省固沙所章古台实验林场的樟子松林内。樟子松标准地建立于1985年，林龄25年，胸径15 cm，树高15 m，枯梢病发病率70%以上，适合进行生物防治。

（2）野外应用时间：2010、2011年连续两年进行防治。2010年以浓度梯度筛选试验为主，2011年以对比试验为主。对樟子松枯梢病的防治采用病害控制方式，病害控制时间选择在树木发病后。

（3）菌剂制备：根据高效菌株筛选结果，采用国内菌株T-C14和引进菌株T-43制备菌剂，进行野外应用研究。菌剂采用孢子粉剂和液体菌剂两种。

孢子粉剂的制作：将木霉孢子液加入菌糠培养基中，25℃恒温培养7 d后，用灭菌玻璃棒搅拌培养料，促进产孢。3 d后收获培养料，风干，过200目筛，制备孢子粉剂。其中菌株T-43孢子粉剂浓度为3.2×107g，菌株T-C14孢子粉剂浓度为1.7×107g，分装后4℃保存备用。

液体菌剂的制作：将木霉孢子液接种于300 mL PD培养基中，25℃恒温震荡培养7 d，过滤去除菌丝，将发酵液与乙酸乙酯按1:3的比例（V/V）进行萃取，2 d后分液去除无机相，将有机相进行减压浓缩，后用5%的Tween80溶解制备液体菌剂。

（4）菌剂施用方法：2010浓度梯度试验：设定不同浓度梯度菌剂进行野外应用研究。菌剂为孢子粉剂和液体菌剂。浓度设定见表4每个浓度梯度防治20株树，设3个重复，设定空白对照。采用树冠喷雾的方式施药。用药时间为2010年7月10日、7月20日和7月30日。2010年9月调查病情指数，利用SPSS统计软件进行差异显著性分析，筛选最佳浓度梯度。

2011对比试验：以T-43为目标菌株制备孢子粉剂和液体菌剂进行野外应用研究。同时选用商品化的木霉分生孢子可湿性粉剂作为对照，浓度设定见表5。每个处理20株树，设3个重复。菌剂施用时间为2011年7月10日、7月20日和7月30日。2011年9月调查病情指数，利用SPSS统计软件进行差异显著性分析，评价防治效果。

病害损失估计采用分级计数法，以病情指数表示发病程度，病情指数计算：

病情指数=[Σ（病级株数×代表数值）/株数总和×最重一级代表数值] ×100 。

防治效果=（对照区感病指数-防治区感病指数）/对照区感病指数×100% 。

2 结果与分析

2.1 木霉菌株对病原菌的拮抗效果用

各木霉菌株对病原菌株均有不同程度的抑制效果（表2）。对峙培养48 h后， 菌株T-C14、T-C33、T-43、T-19和T-28对病原菌生长抑制率均在50%左右，菌株生长速度较快，竞争系数高，在同病原菌对峙培养中，能迅速占领生态位，最终覆盖病原菌，病原菌在木霉菌株的拮抗下几乎停止生长。与木霉菌株接触的病原菌株，其气生菌丝开始逐渐稀疏甚至萎蔫。菌株T-19、T-C33能越过病原菌生长区域并逐渐将病原菌菌落覆盖，菌株T-43、T-28和T-C14与病原菌之间形成明显的拮抗线，并最终覆盖病原菌。通过比较，引进木霉菌株优势明显，菌株T-28、T-43对病原菌的相对抑制效果达到6以上，在抑制病原菌生长的同时，自身的生长几乎没有受到抑制，而是直接覆盖病原菌，竞争系数最高。

表2 木霉菌株与樟子松枯梢病菌的对峙培养结果Table 2 Antagonistic culture of Trichoderma strains and Sphaeropsis sapinea

图1 菌株T-43（1）、T-28（2）与樟子松枯梢病菌的对峙培养效果Fig.1 Antagonistic culture effects of Trichoderma strains and pathogen (1, T-43, 2, T-28)

2.2 非挥发性代谢产物对病原菌的抑制效果

各菌株的各非挥发性代谢产物及发酵原液对病原菌的生长均有不同程度的抑制效果（表3）。引进菌株中T-43抑菌效果最好，其原液和乙酸乙酯提取物的抑菌率均超过90%；菌株T-28原液和菌株T-13原液的抑菌率分别超过81%和65%。病原菌在平板上菌丝稀疏，生长明显变弱甚至不生长，被完全抑制。国内菌株中，T-C33抑菌效果最好，其原液和乙酸乙酯提取物的抑菌率均超过76%；其次为菌株T-C14，其原液和正丁醇提取物的抑菌率均超过63%。同正己烷相比，正丁醇和乙酸乙酯萃取效果更好，而真空旋转蒸发时，乙酸乙酯沸点更低，同原液相比，萃取后的代谢产物抑菌活性更强。在进一步的野外应用中，以乙酸乙酯为萃取剂进行大规模活性成分的提取制备。

综合对峙培养和抑菌试验结果，选用引进菌株T-43作为防治枯梢病生物菌剂的出发菌株，制备孢子粉剂和液体菌剂进行野外应用研究。以国内高效菌株T-C14作为对照，对比国内外菌株对樟子松枯梢病的生物防治能力，评价应用效果。

表3 木霉菌株代谢产物对病原菌生长的抑制率（%）Table 3 Inhibition rates of extracts to pathogen’s growth

图2 菌株T-28（a）、T-43（b）非挥发性代谢产物对病原菌的抑制效果Fig. 2 Inhibition rates of Trichoderma(a T-28, b T-43) extracts on pathogen’s growth

2.3 木霉非挥发性代谢产物对病原菌的抑菌机理

4种保护酶对木霉菌株T-43发酵液乙酸乙酯提取物均比较敏感，在整个测试过程，都呈现出先上升后下降的趋势（图3～图6），四种保护酶变化趋势基本相同，对照组酶活基本处于缓慢上升的趋势，处理组酶活在10-12 h达到峰值，后迅速下降，48 h后酶活几乎为零。上述结果说明处理组菌体在提取物的逆境胁迫下，前期SOD、CAT、POD和PPO互相协调一致，呈现上升趋势，来发挥它们对菌体的保护作用，后期由于氧自由基的增加和膜脂过氧化的加重，细胞透性增加，蛋白质变性严重，最终导致各种酶含量的降低或消失，菌体死亡。

图3 樟子松枯梢病菌SOD酶活变化Fig.3 SOD enzyme activity changes of Sphaeropsis sapinea pathogen of Pinus sylvestris var. mongolica

图4 樟子松枯梢病菌CAT酶活变化Fig.4 CAT enzyme activity changes of Sphaeropsis sapinea pathogen of Pinus sylvestris var. mongolica

图5 樟子松枯梢病菌POD酶活变化Fig.5 POD enzyme activity changes of Sphaeropsis sapinea pathogen of Pinus sylvestris var. mongolica

2.4 木霉菌剂对樟子松枯梢病控制的野外应用研究

连续两年在樟子松枯梢病发病严重的辽宁省固沙所章古台实验基地樟子松人工林进行木霉菌剂野外应用研究结果显示，不同浓度梯度的菌剂的防治效果存在显著差异，其中引进菌株T43液体菌剂（10倍液）对樟子松枯梢病的控制效果超过94%，孢子粉剂（300倍液）控制效果超过68%。国内菌株T-C14液体菌剂（10倍液）控制效果也超过78%，孢子粉剂（150倍液）控制效果超过63%，引进菌株对樟子松枯梢病的控制能力明显好于国内的高效菌株（表4）。

图6 樟子松枯梢病菌PPO酶活变化Fig.6 PPO enzyme activity changes of Sphaeropsis sapinea pathogen of Pinus sylvestris var. mongolica

2011年在确定菌剂最佳应用浓度的基础上，选择商品化木霉分子孢子可湿性粉剂作为对比。结果表明，T-43液体菌剂10倍液防治效果达到75%以上，分生孢子粉剂效果不理想， T-43分生孢子粉剂防治效果66.67%，对照（木霉分生孢子可湿性粉剂）防治效果72%，均低于T-43液体菌剂（表5）。

表4 木霉菌剂野外应用效果（2010年）Table 4 Field application effects of Trichoderma agent in 2010

表5 木霉菌剂野外应用效果（2011年）Table 4 Field application effects of Trichoderma agent in 2011

3 结论与讨论

3.1 结 论

通过木霉菌株与病原菌株平板对峙培养研究、木霉菌株非挥发性代谢产物抑菌活性研究，高效木霉菌株对病原菌保护酶活性的影响研究以及野外应用研究，得出以下结论：

（1）引进菌株T-43和T-28对樟子松枯梢病菌具有显著的拮抗作用。引进菌株T-43发酵液原液和乙酸乙酯提取物对病原菌抑制效果显著。

（2）引进菌株T-43乙酸乙酯提取物显著降低病原菌保护酶（SOD、CAT、POD和PPO）活性，使病原菌氧自由基增加、膜脂过氧化的加重、细胞透性增加、蛋白质变性严重，最终导致各种酶含量的降低或消失，菌体死亡。

（3） 菌株T-43液体菌剂10倍液对樟子松枯梢病具有显著的控制效果。

3.2 讨 论

樟子松在我国很多地区广泛分布, 具有抗旱、抗逆性强的特点，为三北防护林工程和治沙工程建设的主要针叶造林树种。枯梢病是一种世界上广泛发生的病害，该病主要发生于苗木和中老龄树木上。樟子松枯梢病属于寄主主导性病害，是多种生态因素长期协同作用的结果，属于林木生态病害。单纯的化学防治对该类病害很难奏效，而且会带来一系列环境问题。基于微生态调控的生物防治技术是通过人为引进高效拮抗菌株抑制病原菌，达到保持生态系统平衡，控制病害发生的目的。木霉菌作为普遍存在并具有丰富资源的拮抗微生物,在植病生防中具有重要的不可替代的地位[12]。在土传病害[13-14]、叶部病害[15-16]等的生物防治中发挥了重要的作用，并形成了多个商品化的品种，在生物农药中占据了重要的地位。木霉菌对病原菌的拮抗作用具有广谱性的特点。但不同的种、同种的不同菌株都存在着拮抗活性的差异及拮抗对象种类上的差别。

本研究对来自国内外的28个木霉菌株进行了筛选。在对峙培养中，菌株T-43对樟子松枯梢病菌具有极强的拮抗和竞争作用，对峙培养2 d，对病原菌的抑制率达到60.17%，相对抑制效果为6.05，在抑制病原菌生长的同时，自身的生长几乎没有受到抑制，而是直接覆盖病原菌。笔者其它的试验结果证明，菌株T-43对主要林木病原菌包括：樟子松枯梢病菌Sphaeropsis sapinea、杨树烂皮病菌Cytospora chrysosperma、杨树叶枯病菌Alternaria alternata、沙棘干缩病菌Fusarium sporotrichoides、苗木立枯病菌Rhizoctonia solani、Fusarium oxysporum、Pythium debaryanum均有明显的拮抗作用，说明该菌是适应性较强的广谱性拮抗菌，在病害生物防治中具有广阔的应用开发前景。高克祥对杨树溃疡病的高效拮抗木霉进行了筛选，其中哈茨木霉T-88和深绿木霉T-95对杨树烂皮病菌Cytospora chrysosperma和杨树水泡溃疡病菌Dothiorella gregaria 的抑制率可以达到60%以上，与本文筛选的高效菌株相似。T-43同时具有重寄生作用，通过对峙菌落的显微观察，T-43对樟子松枯梢病菌具有明显的重寄生作用， T-43产生附着胞或者钩状分枝吸附于病原菌的菌丝上，使病原菌菌丝断裂死亡，该结果与Chet的观察结果一致[17-18]。

研究证明，木霉菌的次生代谢产物丰富，可产生挥发或不挥发性的抗生素类物质，如木霉菌素(trichodermin)、胶毒素(gliotoxin)、胶绿木霉素(glioviridin)、绿色菌素(viridin)和抗菌肽(antibiotic peptide)以及挥发性抗菌素等。该功能可以与其它的生防作用机制（竞争作用、重寄生作用、胞壁降解酶等）发挥协同增效作用，达到抑制病原的目的，同时对植物具有促生和诱导抗性的作用[19]。本研究利用不同有机溶剂（正丁醇、乙酸乙酯和正己烷）对木霉的次生代谢产物进行了初步分离和筛选，结果显示菌株T-43原液和乙酸乙酯提取物对枯梢病菌的生长抑菌率均超过90%，病原菌在平板上生长菌丝稀疏，生长明显变弱甚至不生长，被完全抑制。T-43非挥发性代谢产物中抑菌活性成分对病原菌主要的保护酶活性的影响效果显著，在48 h的处理过程中，初期SOD、CAT、POD、PPO酶活呈现上升趋势，10 h左右达到峰值，而后快速下降，24～48 h酶活几乎为零，菌丝死亡，这与计红芳[9]的研究结果一致。冀瑞卿[11]研究毒蘑菇活性成分对杨树烂皮病菌体内自身保护相关酶系的影响、朱天辉[20]研究哈茨木霉代谢产物对立枯丝核菌的影响结果均表明，生防菌中非挥发性代谢产物能强烈抑制病原菌的生长和代谢的正常进行，并破坏病原真菌菌丝的细胞壁和细胞膜，引起菌丝断裂解体，并最终死亡。这些相关酶的变化与本研究的结果基本一致。病原菌保护酶虽然对外界的干扰有一定程度的抵抗作用，但是随着时间的延续，外界干扰导致的病原菌自身保护酶系统的改变过程基本上是一致的。

本研究通过不同的方式对高效菌株进行了评估，包括不同的菌剂类型、不同的浓度梯度、与国内高效菌株和商品化木霉菌剂的比较。菌株T-43在连续两年野外应用中，均取得了良好的效果，可以有效控制病害的发生，说明T-43具有进一步开发商品化木霉菌剂的潜力，笔者计划进一步对其代谢产物的活性成分进行分离纯化和工业化发酵的条件摸索。

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High efficient Trichoderma strains and theirs bio-control effects on shoot blight of Pinus sylvestris var. ongolica

DENG Xun1, SONG Rui-qing2, SONG Xiao-shuang1, YIN Da-chuang2
(1. Forestry Protection Institute of Heilongjiang Forestry Academy, Harbin 150040, Heilongjiang, China; 2. College of Forestry,Northeast Forestry University, Harbin 150040, Heilongjiang, China)

Trichderma strain T-43 which has inhibiting effects on Sphaeropsis sapinea was obtained from 28 domestic and foreign strains by methods of antagonistic culture and growth-inhibiting. The extraction effect of four organic solutions was evaluated by pathogen growth-inhibiting methods. The effect of the extract on pathogen’s protective enzyme activities was systematically studied. Two kinds of Trichoderma agent were prepared to control the shoot blight of Pinus sylvestris var. mongolica on field experiment. The results show that Trichoderma strain T-43 can inhibit the growth of Sphaeropsis sapinea,the inhibiting rate in antagonistic culture was 63.28%, and the relative inhibiting effect was 6.05. The non-violate extract from fermentation liquid of T-43 can inhibit the mycelia growth and the protective enzyme activity (including SOD, POD, CAT, PPO) of pathogen effectively. In field experiments of controlling shoot blight of Pinus sylvestris var. mongolica, the liquid agent was better than conidia WP.

Trichoderma; shoot blight of Pinus sylvestris var. mongolica; inhibiting mechanism; bio-control

S763.1

A

1673-923X(2012)11-0021-07

2012-10-10

948引进项目（2009-4-39）；黑龙江省森工总局项目（SGZJY2010014）

邓 勋（1978-），男，辽宁丹东人，副研究员，博士，主要从事微生物开发利用研究；E-mail:dxhappy@126.com

宋瑞清（1964-），女，黑龙江哈尔滨人，教授, 博士生导师，主要从事菌物开发及利用领域的研究

[本文编校:吴 毅]