缺血-再灌注对股骨头关节软骨细胞分化及基质稳定性的影响

杜志昭，陈海英

(1.福建漳州卫生职业学院，福建 漳州 363000;2.福建莆田学院，福建 莆田 351100)

缺血-再灌注对股骨头关节软骨细胞分化及基质稳定性的影响

杜志昭1，陈海英2

(1.福建漳州卫生职业学院，福建 漳州 363000;2.福建莆田学院，福建 莆田 351100)

目的:探讨缺血-再灌注对股骨头关节软骨退行性变的影响。方法:建立髋关节缺血再灌注模型，大鼠随机分为正常组、模型组。于术后不同时点取股骨头关节软骨进行苏木精-伊红染色观察缺血-再灌注后股骨头关节软骨的病理组织学结构改变;利用Van Gieson胶原纤维染色法观察胶原纤维沉积变化;观察VEGFmRNA原位杂交表达。结果:关节软骨形态结构逐渐紊乱，再灌注后软骨细胞明显减少，差异均有显著性意义(P﹤0.01)。结论:缺血-再灌注可加重股骨头关节软骨的损伤，细胞增殖活性下降及细胞环境不稳定可能是缺血－再灌注早期股骨头关节软骨损伤的重要机制。

缺血-再灌注;关节软骨;软骨细胞;胶原纤维;VEGFmRNA;原位杂交

缺血性损伤是由急性血液供应障碍而导致细胞坏死引起。临床上发现当缺血的关节软骨恢复血液供应后，关节软骨损伤却仍在继续，并且有加重的现象，即缺血－再灌注(ischemia-reperfusion，I/R)损伤。I/R是血供重新恢复后给机体带来的进一步损伤，是骨科和创伤外科的研究热点，目前对心、肝、脾、肾等脏器损伤研究较多，但对关节软骨I/R损伤的研究很少，软骨组织内不含血管，不象其他器官容易遭受缺血的影响，使得I/R损伤的研究进展缓慢［1－4］。本文仅对I/R关节软骨的软骨细胞及细胞环境的稳定性进行研究探讨，实验从细胞增殖状况、Van Gieson氏胶原纤维染色、VEGF原位杂交等代谢水平等观察I/R关节软骨的软骨细胞增殖及细胞分布、基质代谢等方面对关节软骨的修复作用。

1 材料与方法

1.1 建立大鼠股骨头骨骺I/R损伤的动物模型

清洁级4月龄健康成年SD大鼠，体重200～220 g，购自福建医科大学动物室(动物合格证号:闽实动质准第2002－0006号)。雌雄不拘，塑料代谢笼分笼、普通块料饲养，饮自来水。将大鼠随机分为正常组(CON)10只;模型组(DM)20只。采用髂总动脉阻断开放法建立大鼠股骨头骨骺I/R模型:分离髂总动脉，在两侧髂总动脉分叉处以下用无创血管夹夹闭左侧髂总动脉，到达再灌注时间点后松开血管夹，分别记录缺血和再灌注时间。2组分别在缺血5 h、24 h组再灌注，每组在再灌注后即刻、24 h、168 h分批麻醉下处死实验大鼠，每组每个时间点6只，正常组在实验条件下即刻处死动物取标本，实验中标本均取自实验侧。将标本分为2份。

1.2 关节软骨标本的制备，组织学观察及图像分析

标本放入4%多聚甲醛溶液中固定24～36 h，逐级脱水脱脂后，再以10%乙二胺四乙酸(EDTA)脱钙，石蜡包埋切片，酸处理、烘干后用多聚赖氨酸包被干燥，观察软骨细胞与细胞外基质分布。

1.3 关节软骨组织计量学指标比较

关节软骨切片在普通显微镜下，进行软骨细胞密度测定:镜下计算每1 mm×1 mm关节软骨中软骨细胞的数量。同样要求在不同10个视野各测定一次，取平均值。

1.4 Van Gieson氏胶原纤维染色

关节软骨脱钙，包埋、切片，以Van Gieson氏进行胶原纤维染色，光镜下观察胶原纤维沉积情况。选择有意义的组织相片，经登录、编号、采集、分析、读取数据、存盘。在每张切片关节软骨下区各随机选10个视野测定，用图像分析仪测定单位面积内胶原纤维沉积情况。

1.5 VEGF原位杂交表达

按照VEGFmRNA寡核苷酸探针杂交试剂盒(武汉博士德)，具体步骤操作，DAB显色、苏木素复染;显微镜观察，图象分析。探针序列(河北博海公司提供):5'-GCTCT ACCTC CACCA TGCCA AGTGG TCCCA-3'，5'-GACCC TGGTG GACAT CTTCC AGGAG TACCC-3'，5'-GCAGC TTGAG TTAAA CGAAC GTACT TGCAG-3'阴性对照:原位杂交过程用预杂交液替代探针工作液，其余步骤同上杂交试剂盒。光镜下选择生长板结构进行观察。

光镜下分别选择股骨头关节软骨结构进行观察、照相、编号、采集、分析存盘。

1.6 统计学分析

统计学分析测定和计量数据采用SPSS13.0统计软件进行，采用两个独立样本t检验，比较组间差异，P﹤0.05表示差异有统计学意义。所有数据均用均值±标准差±s)表示。

2 结果

2.1 HE染色关节软骨病理组织学改变

正常组关节软骨较厚，软骨细胞清晰(图1)。I/R早期关节肿胀，滑膜在关节缘粘连，软骨表面失去光泽，弹性差。以再灌注168 h后较明显。光镜下所见:缺血期间关节滑膜水肿，少量炎细胞浸润，再灌注后还可见细胞变性、坏死。单纯缺血5 h及24 h，缺血期间关节软骨变化不明显，以后随着时间的延长部分软骨细胞出现核碎裂。再灌注24 h后软骨细胞轻度肿胀，排列疏松，细胞变性明显。再灌注168 h骺板软骨细胞较多核碎裂，并部分核溶解。再灌注后24 h、168 h(图2)和再灌注后即刻比较，其软骨细胞密度差异均有统计学意义(P﹤0.01)(图3)。

2.2 Van Gieson氏胶原代谢结果

正常组大鼠关节软骨的软骨细胞间质染色较浅，胶原纤维均匀分布，排列方向有序(图4)。缺血5 h再灌注24 h后，观察到关节软骨的退行性改变，软骨基质胶原纤维增多。缺血24 h再灌注后24 h、168 h其软骨细胞间质染色较深，胶原纤维增多(图5)，和再灌注后即刻、正常组比较差异均有统计学意义(P﹤0.01)(图6)。

2.3 VEGF原位杂交表达及灰度值结果分析

正常组VEGFmRNA主要表达在关节软骨的软骨细胞中，表现为软骨细胞胞浆和胞膜着色，DAB显色为棕黄色(图7)。缺血5 h再灌注24 h后，观察到VEGFmRNA表达的阳性细胞数增多。缺血24 h再灌注后24 h、168 h其VEGFmRNA表达的阳性细胞数增多、增强(图8)。与再灌注后即刻、正常组比较差异均有统计学意义(P﹤0.01)(图9)。

3 讨论

关节软骨损伤后同其他组织损伤一样，出现梗死面积和血流动力学指标及活性物质释放的改变［5－8］，面临重建问题。当关节软骨缺血性损伤发生时，一方面要实施恢复血流的再灌注，另一方面还要考虑到因再灌注而造成的细胞增殖能力下降。缺血10 h再灌注168 h，关节软骨细胞则可发生核碎裂;当缺血24 h再灌注168 h时，关节软骨细胞则可发生核溶解。这一结果初步表明，I/R可引起骨细胞的损伤，同时随着I/R时间的延长，关节软骨细胞的损伤逐渐加重，软骨细胞仅维持较低水平的新陈代谢。关节软骨细胞的营养与软骨基底的血供有关［9］，关节软骨的营养来源只有靠关节液来维持，与其他组织I/R比较，软骨细胞的易损性明显增加。关节I/R损伤时关节软骨损害的具体机制目前不确切，可能当关节缺血后，关节滑膜和软骨下供血障碍，导致软骨的营养及代谢失调，打破了软骨合成和分解之间的平衡，使关节软骨的分解代谢大于合成代谢。而滑膜的缺血更加影响了滑液的分泌，进一步加重了软骨的损伤。同时肢体I/R损伤时可以产生大量的氧自由基、炎性细胞因子(白细胞介素1、肿瘤坏死因子α)等［10－11］。软骨明显增厚也是一种损伤表现，可能因股骨头软骨靠关节液营养的同时也因软骨下血管受缺血再灌注损伤有关。

另本实验中胶原纤维沉积增多，这可能是实验中未发现软骨细胞增生修复、而促进软骨细胞内氨基酸蓄积，刺激骨胶原合成。这可能与观察时间太短有关，即后期表现为胶原等细胞外基质成分表达的减少，这些问题有待于进一步研究。

VEGFmRNA是一种作用于动静脉与淋巴管内皮细胞的二聚糖蛋白类丝裂原，与组织损伤修复和功能恢复密切相关。VEGFmRNA作用的靶细胞关节软骨细胞可以合成并表达VEGFmRNA。VEGFm-RNA是软骨细胞生长活性可靠指标，能够很好反映其所处的代谢状态。VEGFmRNA表达趋势完全能够体现关节软骨细胞所合成分泌的VEGF的生物学效应。缺血性损伤时体内代谢紊乱和糖毒作用，组织广泛缺血缺氧，导致多种细胞因子和生长因子可上调VEGFmRNA水平或诱导VEGF释放。病程中持续高效地分泌VEGF、纤维蛋白等进入细胞外基质，协同加快软骨转换。实验说明在软骨重建作用较强的组织中，软骨细胞为适应软骨重建的需要而发生细胞增殖功能下降现象越明显，并且在形态学、生化学及各种分子标记技术方面得到证实。软骨组织通过某些基因，诱导和调控细胞增殖能力，使需要重建的软骨细胞和骨基质，达到一种最佳的平衡状态以适应机体活动的需要。

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Ischemia-reperfusion on femoral head articular cartilage cell differentiation and environmental stability

DU Zhi-zhao1，CHEN Hai-ying2
(1.Zhangzhou health Career Technical College，Zhangzhou 363000;2.Putian College，Putian 351100，Fujian，China)

Objective:TO study effect of ischemia-reperfusion by articular cartilage degeneration upon femoral-head.MethodsEstablish the hip joint of is chemia reperfusion model the rats.The rats were random divided into the normal groups and the model groups.In the postoperative time points From the articular cartilage of femoral head，Observe the structure of articular cartilage including cartilage cells，the change of collagen and the expression of VEGFmRNA by HE，Van Gieson，and in Situ Hybridization.ResultsThe model rats'articular cartilage developed with the course of illness，disordered structure，the cartilage cells became few and.small，fiber rose.The expression of VEGFmRNA reduced，the microvessel density enlarged.Conclusion:With the extension of the course，Ischemia reperfusion can exacerbate of articular cartilage of femoral head injury，Cell apoptosis and environmental instability may be ischemia reperfusion of early femoral head articular cartilage injury mechanism.

Ischemia reperfusion;Articular cartilage;Cartilage cells;Collagen;VEGFmRNA;In Situ Hybridization

1005-3697(2012)06-0562-04

R684

A

10.3969/j.issn.1005-3697.2012.06.011

福建省教育厅科研项目(JB08222)

2012-10-12

杜志昭(1968－)，男，福建漳州人，讲师。主要从事解剖学与组织胚胎学教学与科研工作。E-mail:chhyzw@163.com

时间:2012-11-1217∶34

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.201201112.1734.030.html

(学术编辑:谢勇恩)