降纤酶肽图分析

董 宇，矫筱蔓，王晓黎，孙 东

(1．辽宁省食品药品检验所，辽宁 沈阳 110023;2．辽宁诺康生物制药有限责任公司，辽宁 沈阳 110071)

降纤酶肽图分析

董 宇1，矫筱蔓1，王晓黎1，孙 东2

(1．辽宁省食品药品检验所，辽宁 沈阳 110023;2．辽宁诺康生物制药有限责任公司，辽宁 沈阳 110071)

目的 采用反相高效液相色谱法测定尖吻蝮蛇降纤酶和白眉蝮蛇降纤酶肽图。方法 将降纤酶样品用胰蛋白酶水解，酶解所得的肽段通过反相高效液相色谱法进行分析，采用C18色谱柱，以0．1%三氟乙酸为A相，乙腈-水-三氟乙酸(90∶10∶0．1)为B相进行梯度洗脱得到降纤酶肽图。结果 降纤酶各个肽段都能得到很好的分离，白眉蝮蛇降纤酶和尖吻蝮蛇降纤酶肽图存在显著差异。结论 本法简便、快速，可应用于不同蛇种来源降纤酶的鉴别，以减少临床不良反应的发生。

降纤酶;肽图;反相高效液相色谱法

我国降纤酶使用始于20世纪90年代，1997年国家卫生部将以尖吻蝮蛇(Agkistrodon acutus)和长白山白眉蝮蛇(Gloydius ussuriensis)蛇毒为原料提取的类凝血酶制品正式命名为降纤酶(Defibrase)，制定并试行统一的质量标准(于2003年上升为国家药品标准)，以规范其产品质量。然而，在临床使用过程中，降纤酶不良反应时有发生，常见的有患肢出血、皮下出血、皮肤出血、颈髓硬膜外出血与脑干出血等［1-2］。其原因在于不同来源的降纤酶具有不同的一级序列，在作用机理、空间结构、免疫原性等方面也存在很大的差别。本文采用反相高效液相色谱法，对两种不同来源的降纤酶进行肽图分析，确定其一级结果的完整性和准确性，对两种不同来源的降纤酶进行鉴别和质量控制。

1 仪器与药品

美国Waters公司2695高效液相色谱仪，配有2996二极管阵列检测器及2487紫外检测器。

白眉降纤酶及尖吻降纤酶由辽宁诺康生物制药有限责任公司提供;胰蛋白酶(TPCK处理)，Promega试剂公司;三氟乙酸、乙腈为色谱纯;Millipore超纯水;其它试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2．1 色谱条件

色谱柱:岛津 VP-ODS(250 mm ×4．6 mm，5 μm);检测波长:214 nm;柱温:30 ℃;流速:1．0 mL/min;进样量:50 μL。流动相A为0．1%三氟乙酸溶液，流动相 B 为乙腈-水-三氟乙酸(90∶10∶0．1)。梯度洗脱程序为:0～4 min，2%流动相 B;4 ～150 min，2% ～40%流动相B;150 ～155 min，40% ～2%流动相B。

2．2 样品处理

称取样品适量，加1%碳酸氢铵缓冲液(pH 8．5)制成1 mg/mL溶液。按50∶1加入胰蛋白酶溶液。37℃水浴保温4 h，95℃加热10 min，10 000 r/min离心5 min，取上清液进样。

2．3 降纤酶肽图比较

从图1中可知，尖吻蝮蛇降纤酶分离出15个色谱峰，白眉蝮蛇降纤酶分离出25个色谱峰，两种降纤酶的肽图存在明显差异。

图1 尖吻蝮蛇降纤酶(A)和白眉蝮蛇降纤酶(B)肽图Fig．1 Peptide mapping of Agkistrodon acutus defibrase(A)and Gloydius ussuriensis defibrase(B)

2．4 白眉蝮蛇降纤酶A、B组分分析

在采用反相高效液相色谱系统对白眉蝮蛇降纤酶整体蛋白进行分析时发现，在C18色谱柱上，尖吻蝮蛇降纤酶为单一对称色谱峰，而白眉蝮蛇降纤酶为分叉色谱峰。采用C4色谱柱进行分离后，降纤酶可以完全分离出两个色谱峰，推测白眉蝮蛇降纤酶不是单一组分，而是两种蛋白的混合物。为比较两种蛋白结构的异同点，采用柱色谱方法，对白眉蝮蛇降纤酶进行分离，分别得到两个成分，命名为白眉蝮蛇降纤酶A组分和B组分。对A组分和B组分进行肽图分析，结果见图2。从图2可知，白眉蝮蛇降纤酶A组分和B组分肽图基本一致，仅在110～130 min处，个别色谱峰存在细微差异。

为进一步证实白眉蝮蛇降纤酶A组分和B组分是否存在结构上的明显差异，采用糖苷酶对两种组分进行切糖处理后在C4色谱柱上进行分析，得到保留时间完全一致的色谱峰。

图2 白眉蝮蛇降纤酶A组分(A)和B组分(B)肽图Fig．2 Peptide mapping of component A(A)and component B(B)of Gloydius ussuriensis defibrase

采用离子色谱法对白眉蝮蛇降纤酶A组分和B组分的糖谱进行了测定。取冻干样品适量用水溶解，加入三氟乙酸加热水解后，在离子色谱仪上测定中性糖和唾液酸的种类及含量。结果表明，A组分和B组分均含有唾液酸和三种中性糖葡萄糖胺、半乳糖和甘露糖，且含量基本一致。

采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱(QTOF)对A组分和B组分进行了质量肽图测定。取经胰蛋白酶处理的样品，以0．1%甲酸-水和0．1%甲酸-乙腈为流动相，在C18色谱柱上进行梯度洗脱。结果表明，两组分的TIC及BPI色谱图均无明显差异，且经BiopharmaLynx数据分析软件对两者的色谱及质谱数据进行分析，也无显著性差异。

同时，委托北京大学生命科学院蛋白测序室进行N-末端氨基酸序列测定，测定方法为edman降解法，测序仪器为美国Applied Biosystem公司 PROCISE 491，采用PVDF上样程序。测定结果表明，两种组分的N-末端15个氨基酸完全一致，均为VIGGDECNINEHRFL。

综上，认为白眉蝮蛇降纤酶A组分和B组分为结构极为相近，其结构上的细微差异主要来自于糖基化位点的不同和蛋白质空间结构的不同，且两种组分比活力接近。因此，由现有工艺精制得到的白眉蝮蛇降纤酶可以作为单一蛋白入药，无需再进行细分化。

3 讨论

肽图分析是通过蛋白酶或化学物质裂解蛋白质后，采用适宜的方法鉴定蛋白质一级结构的完整性和准确性，是蛋白和多肽类药物研究中极为有用的一项技术［3-5］。

本文采用反相高效液相色谱法对经胰蛋白酶裂解后的尖吻蝮蛇降纤酶和白眉蝮蛇降纤酶肽段进行分析，在中国药典(2010年)三部附录——肽图检查法的基础上，对流动相组成和洗脱梯度进行优化，得到的肽图色谱峰个数更多，分离效果更佳。两种不同来源的降纤酶肽图存在显著性差异，因此可采用本法进行原料药的鉴别和质量控制。

同时，本文还分别采用肽图、质量肽图测定、N-末端氨基酸序列分析、糖谱测定等分析手段证实了白眉蝮蛇降纤酶A组分和B组分结构极为相近，得出了其可以作为单一蛋白入药的结论，为白眉蝮蛇降纤酶生产工艺的优化提供了有力依据。

［1］ 国家药典委员会．中华人民共和国药典临床用药须知(化学药和生物制品卷)［M］．北京:中国医药科技出版社，2010:513．

［2］ 赵小龙，安慧艳，牛长玲．降纤酶的不良反应［J］．中国药房，2006，17(2):130-131．

［3］ 梁成罡，沈 舒，杨化新．重组人促卵泡激素(rhFSH)肽图分析方法研究［J］．中国生化药物杂志，2010，31(5):333-335．

［4］ 张 慧，辛中帅，李 晶，等．快速液相色谱在重组人胰岛素肽图分析中的应用［J］．药物分析杂志，2008，28(4):575-577．

［5］ 曾文珊，廖海明，杨仲元，等．肽图分析在重组人甲状旁腺素1-34产品质量控制中的应用［J］．中国药学杂志，2006，41(4):1020-1022．

Peptide mapping analysis of defibrase

DONG Yu1，JIAO Xiao-man1，WANG Xiao-li1，SUN Dong2
(1．Liaoning Provincial Institute of Food and Drug Control，Shenyang 110023，China;2．Liaoning Nuokang Biopharmaceutical Co．，Ltd．，Shenyang 110071，China)

Purpose To develop a RP-HPLC method for peptide mapping analysis of Agkistrodon acutus defibrase and Gloydius ussuriensis defibrase．Methods The peptide mapping was obtained by trypsin hydrolysis and RP-HPLC detection．The analysis was performed on a C18column and the mobile phase consisted of 0．1%trifluotroacetic and acetonitrile-water-trifluotroacetic(90∶10∶0．1)with gradient elution．Results The digested fragments were well separated and there was a significant difference between Gloydius ussuriensis defibrase and Agkistrodon acutus defibrase．Conclusion The method is simple and rapid for identification of defibrase from different sources to reduce the occurrence of adverse reactions．

defibrase;peptide mapping;RP-HPLC

R927

A

1005-1678(2012)06-0822-03

2012-01-12

国家科技支撑计划课题(2008BAI55B04-3-2)

董 宇，女，主管药师，硕士，从事药品及食品检验工作，E-mail:cutedongyu@hotmail．com。