亚临界流体萃取高效液相色谱法测定鱼肉中丙酸睾酮残留＊

马勤川，江 洁，薛 勇，薛长湖，韩玉谦

（中国海洋大学食品科学与工程学院，山东青岛266003）

亚临界流体萃取高效液相色谱法测定鱼肉中丙酸睾酮残留＊

马勤川，江 洁，薛 勇，薛长湖，韩玉谦＊＊

（中国海洋大学食品科学与工程学院，山东青岛266003）

采用亚临界1，1，1，2－四氟乙烷（R134a）萃取技术作为样品的前处理技术，建立亚临界流体萃取高效液相色谱法测定鱼肉中丙酸睾酮残留量的新方法。在对添加了丙酸睾酮的罗非鱼肌肉样品亚临界R134a萃取单因素实验的基础上，通过正交实验对萃取条件进行了优化，结果为：萃取压力14 MPa，萃取温度23℃，R134a流量1.0 L／min（标态），静态萃取30 min，动态萃取40 min，共溶剂甲醇添加量2 m L，收集液为甲醇。收集液经石油醚纯化后，用高效液相色谱检测。在最优条件下，方法回收率大于90%、相对标准偏差（RSD）小于5%。最后，对实际样品进行实际检测，鱼肉冷冻干燥样品中丙酸睾酮的残留量为1.37μg／g。本方法首次利用亚临界R134a萃取作为兽药残留分析样品的前处理技术，萃取压力和萃取温度都比较低，易于大规模推广应用。

亚临界萃取；1，1，1，2－四氟乙烷；前处理技术；丙酸睾酮；残留分析；高效液相色谱

丙酸睾酮具有强蛋白质同化作用，能促进畜禽生长，提高饲料转化率，达到大幅度提高动物养殖经济效益的目的，但其在动物性食品中的残留可能会危及消费者的健康，具有潜在的致癌性［1－2］。所以，被大部分国家禁止用于促进动物生长，并不得在食品中检出［3］。

动物组织中性激素残留分析的样品前处理方法大多采用液－液萃取、固相萃取、超临界CO2萃取等［4－6］。液－液萃取和固相萃取费时费力，有机溶剂用量大，对环境有污染，不利于操作人员的健康；超临界CO2萃取虽然具有效率高、选择性好、绿色环保等一系列显著的优点，但同时也存在着操作压力高、设备造价大、不易推广应用等缺点。

近几年新出现的亚临界流体萃取技术，可以在比较低的压力下实现比较好的萃取效果，克服了超临界CO2萃取存在的一些缺点，因而受到了越来越多的重视。由于1，1，1，2－四氟乙烷（R134a）具有临界条件（T c＝101.1℃，P c＝4.06 MPa）易于达到、低毒、惰性、不易燃以及不破坏臭氧层（ODP＝0）等特点，所以成为亚临界流体的首选［7］。但是，目前国际上对亚临界R134a萃取技术的研究仍主要集中在有关成分的萃取方面［8－10］，未见作为分析样品前处理技术研究的公开报道。仅有Frank C.Calvosa［11］的一篇关于室内灰尘中多溴联苯醚（PBDEs）残留样品前处理技术的报道，但采用的是超临界状态的R134a，仍归属于超临界流体萃取技术。

本文首次采用亚临界R134a萃取技术作为生物样品残留分析的前处理技术，通过对罗非鱼肉中丙酸睾酮萃取操作条件的优化，建立了1种亚临界流体萃取高效液相色谱检测鱼肉中丙酸睾酮残留量的方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

亚临界R134a萃取装置（自制），萃取釜容积为50 mL；RE－52A旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；安捷伦HPll00高效液相色谱仪（美国，Agilent公司），具紫外检测器。Anke GL－20G－Ⅱ高速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂），XO－3200DTS超声波震荡器（南京先欧仪器厂）。

R134a（英国，KLEA公司，纯度大于99.9%）；丙酸睾酮标准品（德国，Dr.Ehrenstorfer公司）；甲醇（色谱纯，天津四友精细化学品有限公司）；石油醚（烟台三和化学试剂有限公司）；罗非鱼（青岛罗非鱼良种场，无丙酸睾酮残留）；鱼饲料（青岛罗非鱼良种场）；超纯水。

1.2 丙酸睾酮标准溶液的配制

准确称取10 mg的丙酸睾酮标准品于容量瓶中，用纯甲醇定容至100 m L，得100 mg／L的丙酸睾酮标准储备溶液。系列浓度的标准工作溶液由丙酸睾酮标准储备液配制。

1.3 样品前处理

1.3.1 样品预处理 取鲜活罗非鱼肌肉，切成0.5 cm3的小块，匀浆后冷冻干燥，干燥的鱼肉磨成粉，放入干燥器中备用。

1.3.2 亚临界R134a萃取 亚临界R134a萃取装置及流程分别见图1和2。在萃取釜底部放入玻璃棉，然后准确称取0.5 g预处理的样品放入萃取釜中，加入200μL浓度为100 mg／L的丙酸睾酮标准储备溶液，室温下挥发5 min，然后在萃取釜顶部放入玻璃棉和2 m L甲醇作为共溶剂。打开R134a储罐阀门，液态R134a经过滤器净化后进入冷凝器冷却，经冷却的液态R134a经高压柱塞泵加压，然后经预热器预热后进入萃取釜达到设定的压力和温度。萃取釜的压力控制在设定压力的1±5%范围内。萃取釜通过水浴控温，温度变化小于±1℃。先静态萃取30 min，然后动态萃取一定时间，在分离釜里用10 m L甲醇收集萃取物，R134a的流量控制在1.0 L／min（标态）。

图1 R134a萃取装置Fig.1 R134a extraction device

图2 R134a萃取工艺流程图Fig.2 Schematic diagram of the R134a extraction apparatus

1.3.3 样品的净化 把甲醇收集液转入50 mL离心管中，加入2 mL水和8 mL的石油醚，充分震荡1～2 min，4 000 r／min离心10 min，弃去石油醚层，加入8 m L石油醚按照上述方法再重复操作一次后，甲醇溶液在40℃水浴条件下减压旋转蒸发至干，准确加入5 m L甲醇溶解残渣。经聚四氟乙烯膜过滤，待高效液相色谱分析。

1.4 色谱条件

安捷伦HPll00高效液相色谱仪，检测器：紫外－二极管阵列检测器（检测波长254 nm）；色谱柱：Zorbax SB－C18（4.6 mm×250 mm，5μm）；流动相：甲醇－水（V∶V＝80∶20），流速0.8 m L／min；柱温：30℃；进样量：20μL。

1.5 实际样品的准备及检测

称取1 kg的鱼饲料和200 g的淀粉，充分混匀。然后称取5 mg的丙酸睾酮溶解于200 m L的乙醇水溶液（V∶V＝50∶50）后，均匀喷洒在鱼饲料上，充分拌匀，避免结块。喷拌好的饲料封闭12 h，在阴凉处凉24 h后使用。

随机捞取罗非鱼苗（约200 g）5尾置于0.8 m×0.5 m×0.4 m的水池中蓄养。试验期间温度控制在25℃左右。每天投喂2次，投喂量为鱼体总重量的5%。每天换水1次，换水量为水箱总体积的1／3，保持水环境良好。连续投喂扮有丙酸睾酮的饲料30 d，然后取鲜活罗非鱼肌肉，切成0.5 cm3的小块，匀浆后冷冻干燥。把干燥后的鱼肉磨成粉，称取0.5 g鱼肉冷冻干燥样品进行亚临界萃取和纯化，待高效液相色谱仪分析。

2 结果与讨论

2.1 标准曲线和检出限

由丙酸睾酮标准储备液用甲醇配成2、4、6、8和10 mg／L系列浓度标准工作曲线溶液。将系列浓度分别进样20μL，在高效液相色谱仪上测定峰面积，测得丙酸睾酮标准曲线方程为y＝52.93x－25.386，相关系数r＝0.999 2，说明丙酸睾酮检测浓度在2～10 mg／L范围内线性关系良好。在3倍信噪比下，检出限为0.1 mg／L。

2.2 亚临界R134a前处理条件的优化

影响亚临界R134a从鱼肉中萃取丙酸睾酮回收率的主要因素包括样品含水率、萃取模式、萃取压力、萃取时间、萃取温度、R134a流量、共溶剂的种类和添加量、吸收剂的种类等，可以看出影响本实验的因素比较多，因此对提取过程的合理优化就变得异常重要。所以，本实验在进行正交优化实验设计之前，通过预实验对部分影响因素首先进行了研究和确定，发现以冷冻干燥后的鱼肉（水分含量≤3%）作为萃取样品、共溶剂为甲醇（添加量为2 m L）、萃取模式为先静态萃取30 min后再进行动态萃取（R134a流量1 L／min）、吸收剂为甲醇的实验条件下，可以得到比较好的萃取回收率。在上述预实验结果的基础上，再以影响亚临界R134a萃取效果的最主要的3个关键因素：萃取压力、萃取温度和动态萃取时间为正交实验法的影响因素，设计了L9（33）正交实验，因素水平见表1。正交实验指标以丙酸睾酮的萃取回收率为评价指标，回收率越高，表明实验条件越佳，结果见表2。

表1 正交试验因素和水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

表2 正交试验结果与分析Table 2 Results and analysis of orthogonal test

从表2可以看出，9个正交实验的样品回收率的全部结果都在70.68%～94.75%之间，全部达到了国际上对兽药残留检测方法回收率在70%～120%的要求（Criteria by AOAC／FAO／IAEA／IUPAC），说明采用亚临界R134a萃取技术作为鱼肉中丙酸睾酮残留分析样品的前处理技术是完全可行的。此外，在最优的实验条件（A3B3C1）下，即压力14 MPa，动态萃取时间40 min，温度23℃时，样品的回收率达到了94.75%，说明最优的实验条件下，本方法的准确度高。根据极差大小，可以判断各因素对丙酸睾酮回收率的影响程度。因素的主次关系为：压力＞动态萃取时间＞温度。随着压力的升高和动态萃取时间的延长，丙酸睾酮的回收率逐渐增加，这是因为亚临界R134a的密度随着压力的升高而升高，而动态萃取时间的延长说明溶剂的用量在增加，溶剂密度和用量的提高都意味着溶解能力的相应提高。但是，温度的升高对丙酸睾酮的回收率却是呈下降趋势的，在低温条件下回收率较高。这可能是因为随着温度的升高使得亚临界R134a的密度降低，分子间距增大，分子碰撞的几率减小，从而导致溶解物质的能力下降所造成的［12］。

亚临界R134a对脂溶性物质具有比较强的萃取能力，所以对鱼肉中脂溶性的丙酸睾酮具有比较理想的萃取效果。但与此同时，鱼肉中的脂肪和其它一些脂类成分也不可避免的会被同时萃取出来，如果不加以适当的净化处理，会对后续离线的HPLC检测形成干扰。所以，本实验在亚临界R134a萃取完成后，仍需要用少量石油醚对甲醇收集液进行了脱脂净化，然后再进行HPLC检测，以完全消除脂类成分的影响和干扰。今后的研究过程中有必要重点研究利用预萃取净化技术、固相吸附净化和色谱联用等技术实现在线脱脂，以解决后续使用有机溶剂脱脂净化这一问题。

2.3 方法的准确度和精密度

取罗非鱼鱼肉冷冻干燥样品3份，各0.5 g，分别加入丙酸睾酮标准溶液100、150和200μL，使鱼肉中丙酸睾酮的含量达到10、15、20μg。在相同的优化实验条件下（压力14 MPa，温度23℃，静态萃取30 min，动态萃取40 min，共溶剂甲醇2 m L，流量1 L／min）进行丙酸睾酮加标回收实验，每组重复3次，回收率均在90%以上，RSD小于5%（见表3）。说明本方法对鱼肉中丙酸睾酮的检测重现性好，准确度高。

表3 丙酸睾酮加标回收率实验结果Table 3 Spiked recoveries of testosterone propionate

2.4 实际样品的测定结果

用含有丙酸睾酮的饲料投喂罗非鱼，使得鱼体内累积丙酸睾酮，用此鲜活罗非鱼肌肉进行实际检测，验证所建方法的可行性。取罗非鱼鱼肉冷冻干燥样品0.5g用于亚临界R134a提取前处理，实验结果为对实际样品中丙酸睾酮的残留量为1.37μg／g，说明亚临界R134a萃取技术作为鱼肉中丙酸睾酮残留分析样品的前处理技术是完全可行的。

3 结语

本实验在最优条件下，亚临界R134萃取鱼肉中丙酸睾酮的加标回收率均在90%以上，RSD＜5%，并通过对实际样品的检测进行了方法的验证，证明了亚临界R134a萃取技术作为鱼肉中丙酸睾酮残留分析样品的前处理技术是完全可行的。本方法中亚临界R134a萃取过程只需1h左右，有机溶剂用量仅为常规方法的1／10，与常规方法比较，本方法具有萃取和分离同步完成，操作周期短，分析效率高，环境污染少，分析结果准确、可靠等特点。

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Determination of Testosterone Propionate Residues in Aquatic Products Using Subcritical 1，1，1，2－tetrafluoroethane（R134a）Extraction and Liquid Chromatography

MA Qin－Chuan，JIANG Jie，XUE Yong，XUE Chang－Hu，HAN Yu－Qian
（College of Food Science and Engineering，Ocean University of China，Qingdao 266003，China）

Using Subcritical 1，1，1，2－tetrafluoroethane（R134a）extraction as sample preparation technique，a new subcritical fluid extraction－liquid chromatography method for determination of testosterone propionate residues in aquatic products was developed.Tilapia muscle fortified with testosterone propionate was dealt with subcritical R134a extraction，and on the basis of single factor experiments，orthogonal design experiments was used to optimize the effecting factors.The optimized extracting conditions were as follows：pressure 14 MPa，temperature 23℃，static extraction time 20 min，dynamic extraction time 40 min，cosolvent 2 m L methanol，and 1.0 L／min R134a flow.Methanol was used as collecting solvent，and the residues were purified by liquid－liquid extraction with petroleumether and determined by HPLC.The average recovery of testosterone propionate was greater than 90%，and the RSD were less than 5%.Finally，the positive tissue control was measured in practice，and the residue of testosterone propionate was 1.37μg／g.It is for the first time at home and abroad that subcritical R134a extraction was used as pretreatment technology for residue analysis.And subcritical R134a extraction has low extraction pressure and temperature，so it can be applied in large－scale application.

subcritical fluid extraction；1，1，1，2－tetrafluoroethane；preparation technique；Testosterone propionate；residue analysis；HPLC

O652

A

1672－5174（2012）09－048－05

国家自然科学基金项目（31071541）；青岛市科学发展计划项目（11－2－4－1－（5）－jch）资助。

2011－06－20；

2012－05－17

马勤川（1983－），男，硕士生。E－mail：maqinchuan87＠163.com

＊＊通讯作者：E－mail：hanyuqian＠ouc.edu.cn

责任编辑 朱宝象