高产Nisin和高产LAB EPS乳酸菌共生株筛查

弓耀忠 王 呈

（山西省食品质量监督检验中心，太原 030012）

高产Nisin和高产LAB EPS乳酸菌共生株筛查

弓耀忠*王 呈

（山西省食品质量监督检验中心，太原 030012）

通过对10株产Nisin乳酸菌株和10株产LAB EPS乳酸菌株进行培养、筛选和测定，筛选出3株高产Nisin的乳酸菌株和3株高产LABEPS的乳酸菌株，进而对3株高产LAB EPS乳酸菌株和3株高产Nisin乳酸菌株进行复合发酵试验，最终筛选出可共生的高产Nisin乳酸菌株和高产LAB EPS乳酸菌株各1株。

Nisin；LAB EPS；乳酸菌；共生

乳酸链球菌素（Nisin） 亦称乳酸链球菌肽或音译为尼辛，是乳酸链球菌产生的一种多肽物质，由34个氨基酸残基组成。食用后在人体的生理pH条件和α-胰凝乳蛋白酶作用下很快水解成氨基酸，不会改变人体肠道内正常菌群以及产生如其他抗菌素所出现的抗性问题，更不会与其他抗菌素出现交叉抗性，是一种高效、无毒、安全、无副作用的天然食品防腐剂。可广泛应用于肉制品、乳制品、罐头、海产品、饮料、果汁饮料、液体蛋及蛋制品、调味品、酿酒、烘焙食品、方便食品、香基香料、化妆品等中。

胞外多糖(exopolysaccharides，EPS)：是一些特殊微生物在生长代谢过程中分泌到细胞壁外、易与菌体分离、分泌到环境中的水溶性多糖，属于微生物的次级代谢产物，对微生物的生长有重要意义。

目前关于乳酸链球菌素和胞外多糖已有大量的文献报道，但研究高产乳酸链球菌素菌株和高产胞外多糖菌株之间共生关系的文献鲜有报道。本文通过对10株产Nisin乳酸菌株和10株产LAB EPS乳酸菌株进行培养、筛选和测定，筛选出3株高产Nisin的乳酸菌株和3株高产LAB EPS的乳酸菌株，进而对3株高产LAB EPS乳酸菌株和3株高产Nisin乳酸菌株进行复合发酵试验，最终筛选出可共生的高产Nisin乳酸菌株和高产LAB EPS乳酸菌株各1株。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

本试验所用的乳酸菌株为乳酸乳球菌（Lactococcus lactis subsp.lactis），其菌种编号为 LA02、LA03、LA04、LA05、LA06、LA07、LA08、LA09、LA10、LE03、LE04、LE05。所用明串珠菌(Leuconostoc lactis)菌种编号为 Leu02、Leu03、Leu04、Leu05、 Leu06、 Leu07、 Leu08、 Lvan02、 Lvan04、Lvan05。

1.1.2 培养基

1.1.2.1 菌株保藏及传代培养基

MRS培养基、MC培养基。

1.1.2.2 种子培养基、发酵培养基

MC培养基。

1.1.2.3 乳链菌肽效价测定培养基

以质量分数计：胰蛋白胨0.8%、酵母膏0.5%、葡萄糖0.5%、NaCl 0.5%、Na2HPO4·12H2O 0.2%、琼脂1.5%、pH 6.8，0.55×105Pa灭菌30 min。

1.1.2.4 发酵培养基（代血浆培养基）

蔗糖 130.0 g、蛋白胨 2.0 g、KH2PO40.3 g、Na2HPO41.4g、琼脂15g、蒸馏水1.0L，pH7.0～7.2。

1.1.2.5 发酵培养基

a）脱脂牛乳培养基：采用新鲜无抗牛乳，经脱脂后加入蔗糖（12 g/L） 和植物蛋白胨（35g/L），在115℃灭菌15 min。

b） 代血浆培养基：蔗糖130.0 g、蛋白胨2.0 g、KH2PO40.3 g、Na2HPO41.4 g、琼脂15 g、蒸馏水1.0 L，pH 7.0～7.2。

c） 改良MC培养基。

1.2 分析方法和所用仪器

1.2.1 菌种稀释液浓度测定

用721型分光光度计在600 nm处测定稀释后菌悬液的光密度，以同样稀释度进行试验。

1.2.2 乳链菌肽效价测定

根据WHO规定，1 μg标准批样商品乳链菌肽为1个国际单位。1 μg纯乳链菌肽的效价为40个国际单位。测定指示菌为黄色微球菌（Micrococcus flavus） NCIB8166。

1.2.3 溶液pH值的测定

用pH M82型标准酸度计测定溶液的pH。

1.2.4 菌种活化

菌种首先在MRS培养基中，于37℃下培养24 h，并在4℃下冷藏备用。发酵试验中菌种接种量的质量分数为2%，并按试验要求进行培养和测定。

1.2.5 胞外多糖的分离

发酵液采用12 000 r/min（4℃） 离心30 min，取上清液加3倍体积浓度95%的冷酒精沉淀24 h，于12 000 r/min（4℃） 离心30 min，重复3次，沉淀物溶于重蒸水中，并于4℃下透析24 h。

1.2.6 分析方法

光密度采用721分光光度计测定；pH值用酸度计测定；总糖含量采用硫酸——蒽酮法测定,以葡萄糖作为标准。

1.2.7 拮抗试验

a） 在改良 MC培养皿上，将 LA02、LA09、LA10和Leu02、Leu04、Lvan04两两划十字线，看其有无拮抗性。

b）在改良MC培养皿上，加上NCIB8166指示菌，将 LA02、LA09、LA10 和 Leu02、Leu04、Lvan04两两划十字线，确定其无拮抗性。

c）将无拮抗性的菌株两两在脱脂牛乳培养基中培养，然后将其在代血浆培养皿上分离，确定其在脱脂牛乳中无拮抗性。

2 结果与分析

2.1 10株疑似产N i si n乳酸菌株培养、筛选结果

2.1.1 产Nisin乳酸菌株筛选结果

通过试验，确定LA02、LA09和LA10高产Nisin，其试验结果见图1。

图1 LA02、LE03、LA09和LA10抑菌实验结果

2.1.2 对LA02、LA09和LA10产Nisin的效价测定

将乳酸乳球菌LA02、LA09和LA10种子接于MRS肉汤培养基中，32℃静止培养36 h，测定发酵液的光密度、pH值及乳链菌肽效价。试验结果见表1。

表1 不同菌株发酵液的光密度、pH值及乳链菌肽效价

从表1的结果可知，LA02、LA09和LA10菌株高产Nisin。

2.2 10株产LAB EPS乳酸菌株培养、筛选结果

10株产LAB EPS乳酸菌株在代血浆培养基的发酵数据见表2。

表2 不同菌株的发酵数据

从表2的结果可知，Leu02、Leu04、Lvan04的LAB EPS产量较高。

2.3 共生关系

研究高产Nisin的乳酸乳球菌与高产LAB EPS乳酸菌的共生关系，结果见表3、图2、图3、图4。

表3 共生实验结果

图2 在改良MC培养皿上的培养结果

图3 在加有NCIB8166指示菌的改良MC培养皿上的培养结果

图4 在脱脂牛乳培养基中培养及其分离结果

通过上面的试验可确定高产Nisin的菌株LA02和高产EPS的菌株Lvan04可共生。

3 结论

本试验筛选出了能够共生的高产Nisin菌株LA02和高产EPS菌株Lvan04，为食品工业新产品的开发应用提供了依据。

［1］刘燕，李文献，王少武.高产胞外多糖乳酸菌菌株筛选与鉴定［J］.乳业科学与技术，2009，134（1）：21-25.

［2］顾瑞霞，刘爱萍，骆承庠.不同胞外多糖产生特性的乳酸菌菌种对酸乳品质的影响［J］.乳品工业，2002，30（5）：5-7.

［3］潘道东，吴玲.高产胞外多糖（EPS）乳酸菌菌株的筛选与鉴定［J］.生物工程，2007，28（3）：171-174.

［4］李增利.NISIN的生产、提纯和检测［J］.中国食品添加剂，2004，28（4）：64-68.

Screening of lactic acid bacteria of the highest yield of nisin LAB EPS symbiotic strains

GONG Yao-zhong*WANG Cheng
（Shanxi province food quality inspection and testing center，Taiyuan 030012，China）

Three strains of lactic acid bacteria and three strains of lactic acid bacteria of the high yield of LAB EPS are screened based on 10 strains producing Nisin lactic acid bacteria strains and 10 strains of producing LAB EPS strain of lactic acid bacteria were cultured，screened and determinated.One strain with high yield of Nisin strains of lactic acid bacteria symbiotic with one strain with high yield of EPS strains of lactic acid bacteria is screened by fermentation experiment.

nisin；LAB EPS；lactic acid bacteria；symbiosis

TS252.54

A

1673-6004（2012）01-0038-03

* 弓耀忠，男，1973年出生，2007年毕业于山西医科大学公共卫生学院，硕士，高级工程师

2011-12-07