Ezrin及CD44蛋白在肝癌组织中的表达与意义

邱世云，周 婧，董浦江

(1．重庆市丰都县人民医院检验科 408200；2.重庆市第五人民医院普外科 400062；3.重庆医科大学附属第一医院老年科 400016)

肝癌是常见的一种消化道肿瘤，肝癌细胞转移是造成患者死亡的主要原因之一。研究与肿瘤细胞转移相关基因蛋白表达变化有重要的现实意义。Ezrin与CD44蛋白在肿瘤细胞转移中的作用是一研究热点[1-2]。作者采用Western blot法测定Ezrin与CD44蛋白在肝癌组织中的表达，探讨其表达与肝癌细胞浸润、转移的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集重庆医科大学附属第一医院、重庆市肿瘤医院近1年内手术样本。73例肝癌患者年龄28～73岁，其中，男67例，女6例，均为原发性肝癌。样本取自癌组织边缘组织。术中见有肝内或肝周围淋巴结转移并经病理检查证实为转移性肝癌；肿瘤边界清晰，无明显侵袭现象为无转移肝癌者。73例患者，其中39例有转移，34例无转移。23例肝硬化样本采自肝癌组织边缘5 cm外质地坚硬组织。按Edmondson法进行分级，根据肿瘤形态和分化程度分为Ⅰ～Ⅳ级，其中Ⅰ级6例，均无转移；Ⅱ级26例，12例有转移，14例无转移；Ⅲ级34例，20例有转移，14例无转移；Ⅳ级7例，均有转移。以上样本均经病理检查核实。

1.2主要试剂与仪器 兔抗人Ezrin抗体、鼠抗人CD44蛋白抗体、兔抗人β-actin蛋白抗体(美国Santa cruz公司)，电泳试剂盒(武汉博士德公司)，发光试剂盒(武汉博士德公司)，蛋白提取液(武汉博士德公司)，图像分析系统(美国BID-RAD公司 Chemi DOCXRS)。

1.3肝癌组织蛋白提取液 取液氮中保存的组织放入研钵，滤纸吸干液体，加入液氮，碾磨至粉末，按1 mg组织粉末/15 μL蛋白提取液加入提取液，充分裂解后，12 000 r/min，离心10 min，取上清液。用Bradford法测定提取液中蛋白含量，调节蛋白含量为3 mg/μL。

1.4Ezrin、CD44、β-actin蛋白表达测定 取上述组织液经100 g/L SDS-PAGE电泳后电转于PVDS膜，50 g/L脱脂奶粉的TBST溶液封闭，经一抗及二抗孵育后，化学发光法显色，图像分析系统拍摄并用Quantity One软件将特异条带灰度数字化,一式3份。计算Ezrin、CD44蛋白表达水平的相对值(Ezrin、CD44蛋白表达系数)，Ezrin、CD44蛋白表达系数= Ezrin、CD44蛋白积分光密度/β-actin蛋白积分光密度。

2 结 果

2.1Ezrin、CD44蛋白在有转移、无转移肝癌和肝硬化组织中的表达 如表1所示，Ezrin、CD44蛋白在有转移的肝癌组织中的表达量明显高于无转移肝癌组织及肝硬化组织中的表达，差异有统计学意义(P<0.01)；无转移肝癌组织与肝硬化组织中的Ezrin、CD44蛋白表达比较，差异无统计学意义(P>0.05)；Western blot法检测有转移肝癌组织、无转移肝癌组织和肝硬化组织中Ezrin、CD44蛋白表达的部分结果，见图1。

2.2Ezrin、CD44蛋白表达与Edmondson法分级的关系 如表2所示。Ⅰ级肝癌组织的Ezrin、CD44蛋白表达与Ⅱ级、Ⅲ级未转移肝癌组织的表达比较，差异无统计学意义(P>0.05)；Ⅳ级肝癌组织的Ezrin、CD44蛋白表达与Ⅱ级、Ⅲ级有转移肝癌组织的表达比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 Ezrin、CD44蛋白表达系数

1:转移肝癌组织;2:无转移肝癌组织;3:肝硬化组织。

图1 Ezrin、CD44蛋白表达情况

表2 Ezrin、CD44蛋白表达与Edmondson法分级的关系

2.3Ezrin、CD44蛋白在肝癌组织中表达量的相关性分析 以低于蛋白表达系数均数3个标准差者为低表达，在此数值以上者为高表达。73例肝癌组织中Ezrin与CD44蛋白表达同是高表达31例，同为低表达29例，高低表达不同13例。Spearman分析结果显示，在肝癌组织中，Ezrin、CD44蛋白表达量之间有显著的相关性(r=0.832 2，P<0.05)。

3 讨 论

Ezrin为膜-细胞骨架连接蛋白，相对分子质量为81×103，属于ERM家族成员之一。其主要定位于细胞膜内侧，通过其C端、N端氨基酸残基形成的结构域分别同细胞骨架肌动蛋白和胞膜发生作用[3]。在生理水平下，Ezrin蛋白在细胞中有休眠和激活两种状态，当该蛋白N端与C端分子间的相互作用形成头尾相连的折叠状态时为失活状态；而当C端的苏氨酸磷酸化或N端与磷脂酰肌醇二磷酸盐的结合时呈活化状态[4]。Ezrin蛋白的过表达不仅影响肿瘤转移的某个环节，而且可能参与肿瘤转移的多个环节，如从原发灶脱落、侵入周边组织、侵入脉管系统、穿过基膜、选择性地在靶器官增殖形成转移灶等。对此，国内外均有报道证实，Yu等[5]采用基因芯片技术研究骨肉瘤及横纹肌肉瘤中发现Ezrin蛋白的过表达与肿瘤侵袭、转移相关。Shen等[6]发现Ezrin蛋白可作为骨髓瘤转移的有效指标；Zhang等[7]发现Ezrin蛋白的过表达与肝癌细胞的增殖、侵袭和迁移呈正相关，下调Ezrin蛋白的表达抑制高转移潜能细胞系的侵袭能力。

细胞表面分子CD44蛋白与肿瘤转移之间的密切关系，已经为国内外大量实验所证实[8-10]。CD44分子可以介导肿瘤细胞迁移、侵袭，并且是跨细胞信号转导的重要环节。

有研究者发现，Ezrin蛋白与CD44、Met产物(肝细胞生长因子受体)这些膜受体蛋白分子在调节肿瘤侵袭与转移中具有复杂的相互作用，它们可形成复合体调节肿瘤侵袭与转移。Bonilha等[11]发现CD44分子过表达可激活Ezrin蛋白的功能，从而可导致肿瘤细胞系转移能力的增强。Chai等[12]用免疫组织化学方法研究食管鳞状细胞癌发现，有淋巴转移的瘤细胞中Ezrin、CD44v6的阳性表达率显著高于无淋巴转移的瘤细胞，CD44v6阳性表达的瘤细胞中Ezrin的表达显著高于CD44v6阴性表达瘤细胞。表明Ezrin、CD44v6在瘤细胞中的高表达与肿瘤的侵袭、转移有关。而有关Ezrin、CD44蛋白相互作用促进肝癌转移的研究鲜见报道。本研究结果显示在转移性肝癌组织中Ezrin与CD44蛋白的表达显著高于无转移肝癌组织，该两蛋白表达与病理分级无关，两蛋白在肝癌组织中的表达量相关。表明Ezrin、CD44蛋白在肝癌组织中的高表达与肝癌细胞的侵袭、转移有关，该两蛋白对促进肝癌细胞转移有协同作用。

总之，肝癌组织中Ezrin、CD44蛋白的高表达在肝癌细胞的侵袭、转移中起重要作用，联合检测Ezrin和CD44蛋白表达对更深入地了解肿瘤侵袭和转移的机制以及为临床观察肿瘤患者预后、转移提供可能的参考指标，同时也有可能为肿瘤分子靶向治疗和开发新药物找到另一个突破点[13-14]。

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